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紫玉淮山组织培养技术

2023-03-17 17:30:15

农艳丰,李健

(百色学院,广西百色 533000)

紫玉淮山,山药属,是广东省广州市增城区农业科学研究所从增城区小楼镇当地农家种红肉薯蓣变异株中选育出的优良品系[1]。其营养丰富,含有淀粉、多糖、蛋白质、皂甙、淀粉酶、胆碱、氨基酸、维生素、钙、铁、锌等20 多种营养元素,肉质紫红,特别是花青素含量比普通淮山高[2]。紫玉淮山田间表现为抗病、抗逆性强[3],因此,多地进行推广种植,江西、江苏、福建、广西等均能适应,并通过浅生槽技术栽培获得高产[4-7]。紫玉淮山的生产种植中,利用薯块繁殖,用种数量大,长期种植容易因病毒积累发生种性退化,导致产量和质量下降。组培快繁技术不仅可以加快山药种苗的繁育和推广,也是山药种苗脱毒复壮的有效手段。

目前国内对山药组培技术开展了较多的研究。王碧琴等[8]利用紫山药的茎尖、茎段为材料开展组织培养,观察得出两者初始培养的成活率分别为43%和91%,培养基中添抗了褐化剂,外植体的褐化率降低。韩晓勇等[9]选用台州紫山药带腋芽的茎段为材料开展组织培养,筛选出适宜的诱导芽分化培养基和生根培养基。朱海萍等[10]则采用紫色薯蓣块茎进行快繁,成功诱导愈伤组织并诱导丛生芽。陈芝华等[11]采用‘明淮2 号’褐苞薯蓣带腋芽茎段为外植体进行山药组培快繁体系的优化,完善了山药组培快繁技术体系。但紫玉淮山的组织培养尚未见有研究报道。由于不同类型山药组培快繁存在一定差异,不能满足紫玉淮山的组培快繁生产要求,因此需要参考其他品种山药的技术以建立其组织培养技术体系。本文以紫玉淮山嫩茎作为外植体进行组培快繁技术研究,为紫玉淮山种苗工厂化生产提供技术基础。

试验以紫玉淮山的块茎为试验材料,催芽长出幼苗后待用。取长势一致的紫玉淮山嫩茎,去掉叶片,从茎尖至下依次取2 节,作上、中、下部3 个处理,切成2~3 cm 带腋芽的茎段。洗衣粉溶液浸泡10 min,自来水冲洗10 min,在超净工作台中使用75%酒精灭菌30 s,无菌水冲洗1 次,再使用0.1%升汞灭菌,上部茎段浸泡时间为4 min、6 min、8 min;
中部茎段浸泡时间为6 min、8 min、10 min;
下部茎段浸泡时间为8 min、10 min、12 min。升汞灭菌后,无菌水漂洗5 次。共9 个处理,每个处理接种30 个茎段在MS+1 mg/L KT 培养基上。培养15 d 后统计每个处理的污染数、存活数、褐化数。

污染率(%)=污染外植体数/接种总数×100

存活率(%)=存活外植体数/接种总数×100

褐化率(%)=褐化外植体数/接种总数×100

1.1 初代培养

以最佳灭菌方案处理外植体后,分别接种于MS+KT(0 mg/L、1 mg/L、2 mg/L、3 mg/L、4 mg/L、5 mg/L)的初代培养基中,共设6 个处理,每个处理分别接种30 个外植体,培养30 d 后,统计每个处理茎段的萌芽数和总芽数,计算萌芽率和增殖系数。

萌芽率(%)=萌芽的外植体数/接种外植体数×100

增殖系数=芽总数/接种外植体数

1.2 继代培养

取初代培养诱导获得的无菌芽切成不带叶子的茎段接种在MS+3 mg/L KT+(0mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L、0.4 mg/L)NAA 培养基,每个处理接种30 个外植体,共5 个处理。培养30 d 后,统计每个处理萌发的芽数和芽高,计算茎段的增殖系数,记录各处理的长势。

1.3 生根培养

取长势健壮的无菌芽,将其切成3~4 cm,接种在MS、1/2MS+NAA(0 mg/L+0.1 mg/L,0.3 mg/L、0.5 mg/L)处理的培养基中,每种培养基都添加1 g/L 活性炭。共5 个处理,每个处理接种30 个无菌芽。30 d 后,分别统计生根无菌芽数、总根数,计算紫玉淮山组培苗的生根率、平均根数。

生根率(%)=生根芽数/接种总芽数×100

平均根数(条)=总根数/生根芽数

1.4 培养条件

培养温度为25 ℃,光照强度为2000~3500 lx,光照时间为16 h。

1.5 驯化移栽

将生长健壮大致一致的组培苗移出培养室,在室温炼苗3 d。取出清洗组培苗基部干净,用1%(质量体积比)多菌灵溶液浸泡根部20 min 后沥干水分,再移栽到不同配方的基质中。移栽基质设置4 组,分别为蛭石与营养土=1∶3、有机肥营养土、干净的沙子、沙子与菜园土=1∶3。每个处理30株。1 个月后统计成活率。

成活率(%)=成活株数/移栽总数×100

2.1 取材部位及灭菌时间的筛选

以不同部位紫玉淮山茎段进行不同灭菌处理,探讨适宜的取材部位和灭菌时间。如表1 所示,使用0.1%升汞作为灭菌剂对紫玉淮山茎段灭菌效果好,整体上污染率均达到15%以下。存活率以中上部为较好,达70%以上,褐化率随着灭菌时间的增加而增大,茎段越老褐化越程度越高。综合考虑,为达到理想灭菌效果,减少褐化率,保持存活率,试验取材应以中上部茎段为宜,灭菌时间以0.1%升汞处理4~8 min 为宜。

表1 0.1%升汞不同灭菌时间对紫玉淮山不同部位茎段的灭菌效果

2.2 KT 对茎段培养诱导萌芽的影响

KT 为细胞分裂素,具有诱导芽的分化、促进侧芽萌发生长的作用。茎段初代培养中,侧芽不断萌发、生长,逐渐长成芽丛,反复切割,转接至继代培养基中进行增殖培养,便可以在短期内获得大量的芽(图1)。由表2 可知,同处理中,上部茎段(茎尖)的萌芽率和增殖率皆高于中下部茎段,萌芽率最高可达100%,中下部的萌芽率最高均不超过77%;
添加了KT 的处理中,增殖系数相对于对照组呈显著差异,上中部茎段在添加KT 2~4 mg/L 处理中,增殖系数均高于2.0,而下部的茎段整体增殖系数均不到1.0,可能与下部腋芽活跃程度有关。综合萌芽率和增殖系数考虑,初代培养的培养基适合选用MS+3 mg/L KT 培养基,以上部茎段为外植体的萌芽率和增殖系数最高。

图1 MS+3 mg/L KT 培养基在紫玉淮山初代诱导中的应用效果

表2 KT 对紫玉淮山茎段诱导萌芽的效果

2.3 不同激素组合对继代增殖的影响

在添加KT 3.0 mg/L 培养基基础上,添加不同浓度的NAA,探讨生长素和细胞分裂素配合使用是否具有协同作用。由表3 可知,每个处理增殖系数达到2.5 以上,其中添加了NAA 0.1 mg/L 和0.2 mg/L 的处理达到显著差异。各个处理的平均芽高均达到3.0 cm 以上,并出现显著差异。长势则以添加NAA 0.1 mg/L、0.2 mg/L 和0.3 mg/L 的处理为好,见图2。综合增殖系数、平均芽高和长势考虑,继代培养最佳的激素组合为MS+KT 3 mg/L+NAA 0.1~0.2 mg/L。

表3 不同浓度NAA 与KT 组合对继代增殖的效果

图2 紫玉淮山继代培养效果

2.4 生根培养

将生长健壮一致的无菌芽接种到生根培养基中。生根培养7~10 d,无菌苗基部开始着生1~3 条白或粉红色粗短的须根,15 d 后底部逐步长白色主根,见图3。由表4 可知,MS 减半的培养基更适合诱导生根,同时添加了生长素NAA 的处理生根率均达到80%以上,平均根数可达4 条以上,根系长,较粗,植株叶呈淡紫色。综合考虑,生根培养基选用1/2 MS+NAA 0.5 mg/L 培养基较好,其生根率高,植株生长健壮,选用此激素配方培养出的健壮组培苗,更能适应下一步的炼苗移栽。

表4 不同培养基对生根培养的效果

图3 紫玉淮山生根培养效果

2.5 驯化移栽

由表5 的数据可以看出,在不同移栽基质处理中,4 种基质中蛭石∶营养土=1∶3 处理成活率较高(86.7%),其次是有机肥营养土,沙子作为移栽基质的成活率最低。蛭石可以改善营养土结构、调节基质pH、保水性较好,不易结块且透气性强,营养土能为植物提供生长所需的多种养分,蛭石和营养土按1∶3 的体积配比能满足组培苗对养分和水分、基质空气的需求。有机肥营养土所含的矿质元素较多能供给组培苗的生长,但透水性不比蛭石透水性好,容易烂根。细沙透水性强,混合菜园土作为移栽基质可以增强透水透气。移栽组培苗叶片整体呈紫绿色。长势好的处理,叶片较大,叶柄粗壮些,综合结果,以蛭石与营养土配比1∶3 为最优的方案。

表5 不同移栽基质对组培苗移栽的效果

植物组织培养过程中,淮山外植体普遍存在着褐化现象。试验切割组培材料时,经常发现外植体枯死,及基部培养基黑褐化的现象[12]。嫩茎的不同部位诱导腋芽萌发的效果不同,本实验将嫩茎分为三个部分分别来探讨合适的外植体,发现中上部作为外植体较合适,可能是因为其木质化程度低,不容易褐化,细胞活跃,腋芽容易诱导出来。植物组织和细胞的增殖、分化、生根过程中,受到内源激素和外源激素共同调控。本实验中,添加活性炭作为抗褐化剂,具有良好的效果。唐君等[13]认为,淮山组织培养过程中,品种基因型和培养基中激素配比会对外植体的诱导培养及植株再生造成一定影响。不同阶段的组织培养中,外植体所需的外源激素种类、浓度和配比并不完全一致。因此,在植物组织培养过程中,我们应根据植物各个生长阶段的需要,选用合适的培养基。通常来说,淮山组织培养过程中,NAA 和2,4-D 为常用的生长素,6-BA、KT为常用细胞分裂素。本实验的预实验中,使用6-BA 诱导腋芽萌发的效果一般,KT 的诱导效果明显。对生长素与细胞分裂素配合使用,生长素浓度高时利于生根,而细胞分裂素浓度高时利于长芽。在本次试验过程中发现,初代培养和继代增殖培养阶段,细胞分裂素的影响显著,生长素无明显影响。生根培养中,减少大量元素和不添加外源物对生根率和平均根数影响不大,但生长状况影响较大。

本试验研究表明,对紫玉淮山茎段的灭菌处理及诱导效果,以中上部茎段0.1%升汞处理4~8 min为宜,存活率高,污染率和褐化率低,灭菌效果好,同时诱导萌芽效果较好。初代培养基以MS+3 mg/L KT 较好;
继代腋芽培养增殖率最佳的培养基为MS+KT 3 mg/L+NAA 0.1~0.2 mg/L;
生根培养基宜选用1/2 MS+NAA 0.5 mg/L;
移栽基质为蛭石与营养土配比1∶3。建立的组培快繁体系可为紫玉淮山工厂化生产种苗提供技术基础。

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