职场文秘网

首页 > 心得体会 > 学习材料 / 正文

亚麻叶白千层内生真菌Penicillium,citrinum,YMY-1次生代谢产物研究

2023-03-20 16:00:16

张莎,邓小华,旷敏,彭伟伟,郑雨婷,许立,曾广源,艾卫敏,邹振兴*(1.中南大学湘雅药学院,长沙 41001;
2.慢病诊疗小分子药物发现与转化湖南省重点实验室,长沙 41001;
.中南大学基础医学院人体解剖学与神经生物学系,长沙 41001;
4.湘潭医卫职业技术学院医学基础课部人体解剖学与生理学教研室,湖南 湘潭 411012)

青霉属(Penicillium)真菌是广泛存在于自然环境中的一类腐生类真菌,目前在植物[1]、动物[2]、海洋[3]、土壤[4]中均被报道过。青霉属真菌也是目前研究最多的菌属之一,被认为是药物发现的主要来源,包括来自Penicillium chrysogenum的抗生素青霉素和来自Penicillium griseofulvum的抗真菌药物灰黄霉素[5],其还能产生纤维素酶、蛋白酶和脂肪酶等具有应用前景的酶类,因此在药物的研制、工业原材料的制备、新型酶制剂的筛选以及食品加工业等领域广泛应用[6]。青霉属真菌是多种活性代谢产物的主要生产者,因此目前仍然是广大药物研究者的关注焦点。

课题组前期对亚麻叶白千层(Melaleuca linariifolia)植株进行了系统的化学成分研究,从中分离鉴定出多个活性天然产物[7-9]。为了进一步寻找和发现更多活性天然产物,我们选取亚麻叶白千层植物作为分菌对象,从中分离出多株内生真菌,经活性筛选及TLC 薄层分析发现,有多株菌株代谢产物丰富,对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)显示出较好的抑制活性。菌株Penicillium citrinumYMY-1 是其中一株青霉属真菌,对MRSA 的最小抑菌浓度(MIC)值为0.625 mg·mL-1。因此,为了进一步深入挖掘其次级代谢产物,本实验对该菌株化学成分进行研究,从中分离鉴定出12 个化合物(见图1)。

图1 化合物1~12 的化学结构Fig 1 Structures of compounds 1~12

Bruker AV-400/AV-500/AV-600 型核磁共振仪(德国Bruker 公司);
Agilent 1290 UPLC-6545 accurate mass Q-TOF 色谱-质谱联用仪、Agilent 1200 型分析高效液相色谱仪、Agilent 1100 型半制备高效液相色谱仪(美国Agilent 科技公司);
YMC-pack ODS-A色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);
YMC-pack ODS-A 色谱柱(250 mm×10 mm,10 μm);
大孔树脂D101(安徽三星树脂科技有限公司);
C18反相硅胶(40~75 μm,日本Kasugai);
硅胶(60~100 目,200~300 目,青岛海洋化工有限公司);
Sephadex LH-20 凝胶(德国Healthcare Uppsala Swedeb);
所用试剂均为分析纯。

实验目标菌株分离自亚麻叶白千层枝叶,亚麻叶白千层枝叶于2019年11月采自中国科学院华南植物园,由华南植物园谭海波副研究员鉴定。该真菌由北京擎科新业生物技术有限公司经ITS 序列分析鉴定为Penicillium citrinumYMY-1,目前该样品标本保存于中南大学湘雅药学院天然药物化学实验室。

用接种环挑取适量菌丝接种至装有200 mL马铃薯葡萄糖水(PDB)培养基的三角瓶中,在恒温培养摇床中培养5 d(28 ℃,130 r·min-1),制备得种子液。将种子液接种至无菌大米培养基中,共培养60 瓶,室温下静态发酵培养30 d,得到固体发酵物。发酵完成后用乙酸乙酯将大米发酵物萃取3 次,并将有机溶剂在减压下蒸发以获得粗提物浸膏(60 g)。

乙酸乙酯浸膏经大孔树脂柱层析,采用20%、80%和100%乙醇水洗脱。80%部分经硅胶柱层析,以二氯甲烷-甲醇(100∶0~0∶100)梯度系统,TLC 点板合并得8 个组分(Fr.A~Fr.H)。Fr.C 经ODS 柱层析,采用30%~100%甲醇水梯度洗脱得5 个组分(Fr.C-1~Fr.C-5),化合物12(54 mg)在过柱中析出白色固体。Fr.C-1 经Sephadex LH-20 柱层析,最后经Pre-HPLC 得化合物5(13.1 mg)和6(15.2 mg)。Fr.C-2 经硅胶柱层析,再经Pre-HPLC 得化合物2(9.5 mg)和7(3.2 mg)。

Fr.E 经ODS 柱层析,采用20%~100%甲醇水梯度洗脱得8 个组分(Fr.E-1~Fr.E-8)。Fr.E-3 经硅胶柱层析,以石油醚-乙酸乙醇(20∶1~0∶100)梯度洗脱,得5 个组分(Fr.E-3-1~Fr.E-3-5)。Fr.E-3-3 经Sephadex LH-20 柱层析,再经Pre-HPLC 得化合物3(30.6 mg)、10(16.1 mg)和11(5.7 mg)。Fr.E-3-4 经Pre-HPLC 得化合物1(22.4 mg)。Fr.E-4 经Sephadex LH-20 柱层析,以甲醇为洗脱剂,得4 个组分(Fr.E-4-1~Fr.E-4-4)。Fr.E-4-2 经反复硅胶柱层析,Pre-HPLC 得化合物8(7.8 mg)。Fr.E-4-3 经反复硅胶柱层析,Pre-HPLC 得化合物4(15.0 mg)和9(6.2 mg)。

化合物1:棕色无定型粉末,易溶于甲醇和二甲基亚砜(DMSO),HR-ESI-MSm/z:447.0727 [M+Na]+。1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δH:12.24(1H,br s,8-OH),6.95(1H,s,H-11),6.69(1H,s,H-9),5.99(1H,br s,17-OH),5.88(1H,br s,2-OH),4.24(1H,t,J=6.6 Hz,H-17),4.00(1H,t,J=8.4 Hz,H-3),3.71(3H,s,H-15),3.66(3H,s,H-19),3.47(1H,dd,J=17.4,8.4 Hz,H-4β),3.07(1H,dd,J=17.4,9.0 Hz,H-4α),2.87(1H,dd,J=13.2,4.8 Hz,H-16α),2.79(1H,dd,J=13.8,7.2 Hz,H-16β),2.38(3H,s,H-14)。13C NMR(150 MHz,DMSO-d6)δC:172.8(C-1),79.8(C-2),51.5(C-3),38.0(C-4),122.1(C-5),178.7(C-6),108.7(C-7),160.4(C-8),112.9(C-9),147.8(C-10),108.5(C-11),157.0(C-12),172.3(C-13),22.2(C-14),53.0(C-15),35.1(C-16),71.2(C-17),172.3(C-18),52.1(C-19)。以上数据与文献[10]报道基本一致,化合物1 鉴定为chromosulfine。

化合物2:黄色固体,易溶于甲醇和DMSO,HR-ESI-MSm/z:285.0752 [M+H]+。1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)δH:7.93(1H,t,J=8.5 Hz,H-3),7.73(1H,d,J=8.5 Hz,H-4),7.45(1H,d,J=8.5 Hz,H-2),6.92(1H,s,H-5),6.68(1H,s,H-7),3.90(3H,s,-OCH3),3.40(3H,s,6-CH3)。13C NMR(125 MHz,DMSO-d6)δH:133.4(C-1),123.3(C-2),136.4(C-3),120.0(C-4),155.9(C-4a),155.9(C-4b),107.0(C-5),150.1(C-6),111.9(C-7),161.0(C-8),108.0(C-8a),180.4(C-9),117.1(C-9a),22.5(6-CH3),169.2(-COO-),53.2(OCH3)。以上数据与文献[11]报道基本一致,化合物2 鉴定为methyl 8-hydroxy-6-methyl-9-oxo-9H-xanthene-1-carboxylate。

化合物3:深褐色无定型粉末,易溶于甲醇和DMSO,HR-ESI-MSm/z:381.1697 [M+H]+。1H NMR(500 MHz,CD3OD)δH:6.28(1H,s,H-8),5.21(1H,q,J=6.5 Hz,H-3),4.62(1H,m,H-2"),3.36(1H,m,H-3"),3.26(1H,m,H-4),2.22(3H,s,5"-CH3),2.12(3H,s,6-CH3),1.43(3H,d,J=6.5 Hz,3-CH3),1.38(3H,d,J=6.5 Hz,2"-CH3),1.35(6H,d,J=6.5 Hz,4-CH3,3"-CH3)。13C NMR(125 MHz,CD3OD)δC:158.9(C-1),83.0(C-3),34.6(C-4),130.1(C-5),133.4(C-6),184.2(C-7),102.4(C-8),159.9(C-9),99.3(C-10),87.9(C-2"),44.5(C-3"),140.8(C-4"),117.3(C-5"),148.1(C-6"),101.4(C-7"),135.9(C-8"),137.6(C-9"),19.7(3-CH3),17.9(4-CH3),9.4(6-CH3),17.4(2"-CH3),18.0(3"-CH3),10.5(5"-CH3)。以上数据与文献[12]报道基本一致,化合物3 鉴定为penicitrinone A。

化合物4:深黄色无定型粉末,易溶于甲醇和DMSO,HR-ESI-MSm/z:571.1601 [M+H]+。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δH:15.17(1H,br s,5"-OH),15.01(1H,br s,5-OH),6.94(1H,s,H-7),6.54(1H,d,J=2.4 Hz,H-7"),6.19(1H,s,H-10),6.18(1H,s,H-3"),6.11(1H,s,H-3),5.93(1H,d,J=2.4 Hz,H-9"),4.08(3H,s,6-OCH3),3.93(3H,s,6"-OCH3),3.83(3H,s,8-OCH3),3.47(3H,s,8"-OCH3),2.20,(3H,s,2-CH3),2.04(3H,s,2"-CH3)。13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δC:169.1(C-2),107.0(C-3),184.1(C-4),163.4(C-5),161.7(C-6),93.8(C-7),160.1(C-8),107.5(C-9),98.3(C-10),153.0(C-11),103.6(C-12),108.0(C-13),139.5(C-14),169.1(C-2"),107.2(C-3"),184.5(C-4"),162.6(C-5"),161.5(C-6"),97.0(C-7"),161.9(C-8"),96.9(C-9"),106.9(C-10"),151.0(C-11"),104.0(C-12"),108.2(C-13"),140.6(C-14"),20.4(2-CH3),56.6(6-OCH3),56.7(8-OCH3),20.6(2"-CH3),56.5(6"-OCH3),55.4(8"-OCH3)。以上数据与文献[13]报道基本一致,化合物4 鉴定为rubasperone B。

化合物5:黄色固体,易溶于甲醇和DMSO,HR-ESI-MSm/z:271.1452 [M+H]+。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δH:8.24(1H,d,J=8.0 Hz,H-8),7.83(1H,m,H-6),7.50(3H,m,H-6,H-8,-NH-),4.92(1H,s,H-3),3.85(3H,s,4-CH3),2.18(1H,m,H-1"),1.59(1H,m,H-2"a),1.39(1H,m,H-2"b),1.14(3H,d,J=6.8 Hz,H-4"),0.65(3H,t,J=7.2 Hz,H-3")。13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δC:169.1(C-1),57.4(C-3),36.2(4-CH3),117.6(C-5),133.1(C-6),124.8(C-7),126.3(C-8),172.1(C-9),164.7(C-3a),141.7(C-4a),128.4(C-8a),110.7(C-9a),36.3(C-1"),27.8(C-2"),12.0(C-3"),12.4(C-4")。以上数据与文献[14]报道基本一致,化合物5 鉴定为quinolactacin Al。

化合物6:黄色固体,易溶于甲醇和DMSO,HR-ESI-MSm/z:271.1449 [M+H]+。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δH:8.24(1H,d,J=8.0 Hz,H-8),7.82(1H,m,H-6),7.50(3H,m,H-6,H-8,-NH-),4.84(1H,s,H-3),3.83(3H,s,4-CH3),2.18(1H,m,H-1"),1.00(3H,t,J=7.2 Hz,H-3"),0.87(1H,m,H-2"a),0.81(1H,m,H-2"b),0.44(3H,d,J=6.8 Hz,H-4")。13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δC:169.0(C-1),59.5(C-3),36.5(4-CH3),117.7(C-5),133.1(C-6),124.9(C-7),128.4(C-8),172.1(C-9),165.0(C-3a),141.7(C-4a),126.3(C-8a),110.8(C-9a),36.6(C-1"),21.3(C-2"),12.1(C-3"),18.0(C-4")。以上数据与文献[14]报道基本一致,化合物6 鉴定为quinolactacin A2。

化合物7:白色固体,溶于甲醇和DMSO,HR-ESI-MSm/z:153.0915 [M+H]+。1H NMR(500 MHz,CD3OD)δH:6.20(1H,s,H-6),2.13(3H,s,H-9),2.04(3H,s,H-7),2.03(3H,s,H-8)。13C NMR(125 MHz,CD3OD)δC:154.6(C-1),154.2(C-2),135.3(C-3),115.6(C-4),110.2(C-5),109.8(C-6),11.9(C-7),9.0(C-8),20.3(C-9)。以上数据与文献[15]报道基本一致,化合物7 鉴定为3,4,5-三甲基-1,2-苯二酚。

化合物8:黄色固体,易溶于甲醇和DMSO,HR-ESI-MSm/z:249.1112 [M+H]+。1H NMR(600 MHz,CD3OD)δH:7.56(1H,s,H-6),7.45(1H,q,J=10.8 Hz,H-9),7.23(1H,d,J=14.4 Hz,H-8),6.63(1H,m,H-10),6.36(1H,m,H-11),4.24(2H,dd,J=4.8,1.8 Hz,H-12),2.18(3H,s,3-CH3),2.08(3H,s,5-CH3)。13C NMR(150 MHz,CD3OD)δC:112.5(C-1),162.3(C-2),110.7(C-3),161.2(C-4),116.0(C-5),127.9(C-6),192.3(C-7),123.9(C-8),142.9(C-9),143.0(C-10),128.7(C-11),62.9(C-12),6.6(3-CH3),15.0(5-CH3)。以上数据与文献[16]报道基本一致,化合物8 鉴定为12-hydroxysorbicillin。

化合物9:黄色油状,易溶于甲醇和DMSO,HR-ESI-MSm/z:250.1805 [M+H]+。1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)δH:5.39(2H,m,H-8,H-9),5.22(1H,t,J=6.0 Hz,H-12),3.51(1H,m,H-15a),3.25(1H,m,H-15b),2.28(2H,m,H-13a,H-4a),2.16(1H,m,H-4b),2.00(1H,m,H-13b),1.98(2H,m,H-7),1.88(1H,m,H-14a),1.79(1H,m,H-14b),1.67(3H,s,2-CH3),1.61(3H,d,J=4.0 Hz,H-10),1.45(2H,m,H-5),1.34(2H,m,H-6)。13C NMR(125 MHz,DMSO-d6)δC:162.6(C-1),106.1(C-2),163.5(C-3),30.2(C-4),26.3(C-5),28.9(C-6),32.1(C-7),131.5(C-8),125.1(C-9),18.2(C-10),87.8(C-11),31.6(C-12),21.7(C-13),44.3(C-14),10.4(C-15)。以上数据与文献[17]报道基本一致,化合物9 鉴定为2-(hept-5-enyl)-3-methyl-4-oxo-6,7,8,8a-tetrahydro-4Hpyrrolo[2,1-b]-1,3-oxazine。

化合物10:白色粉末,易溶于甲醇和DMSO,HR-ESI-MSm/z:267.0873 [M+H]+。1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)δH:4.43(1H,dd,J=14.5,7.5 Hz,H-3),2.95(1H,dd,J=14.5,7.5 Hz,H-4),1.98(3H,s,5-CH3),1.16(3H,d,J=7.0 Hz,3-CH3),1.14(3H,d,J=7.0 Hz,4-CH3)。13C NMR(125 MHz,DMSO-d6)δC:166.4(C-1),77.0(C-3),35.0(C-4),111.3(C-5),164.7(C-6),100.3(C-7),161.3(C-8),146.5(C-9),102.4(C-10),20.1(3-CH3),19.3(4-CH3),10.3(5-CH3),175.8(-COOH)。以上数据与文献[18]报道基本一致,化合物10 鉴定为dihydrocitrinone。

化合物11:黄色油状,易溶于甲醇和DMSO,HR-ESI-MSm/z:223.0965 [M+H]+。1H NMR(500 MHz,CD3OD)δH:4.67(1H,qd,J=6.5,1.0 Hz,H-3),3.07(1H,qd,J=6.5,1.0 Hz,H-4),2.10(3H,s,7-CH3),2.08(3H,s,5-CH3),1.28(3H,d,J=7.0 Hz,3-CH3),1.26(3H,d,J=7.0 Hz,3-CH3)。13C NMR(125 MHz,CD3OD)δC:171.1(C-1),81.7(C-3),35.8(C-4),140.9(C-4a),115.2(C-5),161.6(C-6),110.6(C-7),162.6(C-8),99.9(C-8a),20.3(3-CH3),20.1(4-CH3),10.9(5-CH3),8.3(7-CH3)。以上数据与文献[19]报道基本一致,化合物11 鉴定为6,8-dihydroxy-3,4,5,7-tetramethyl-3,4-dihydroisocoumarin。

化合物12:白色固体,易溶于氯仿,HRESI-MSm/z:397.3476 [M+H]+。1H NMR(600 MHz,CDCl3)δH:5.57(1H,dd,J=6.0,2.4 Hz,H-6),5.39(1H,m,H-7),5.19(1H,m,H-22),5.19(1H,m,H-23),3.64(1H,m,H-3),1.03(3H,d,J=6.6 Hz,H-21),0.95(3H,s,H-18),0.92(3H,d,J=6.6 Hz,H-28),0.83(6H,d,J=6.6 Hz,H-27,H-26),0.63(3H,s,H-19)。13C NMR(150 MHz,CDCl3)δC:38.4(C-1),32.0(C-2),70.5(C-3),40.8(C-4),139.8(C-5),119.6(C-6),116.3(C-7),141.4(C-8),46.3(C-9),37.0(C-10),21.1(C-11),39.1(C-12),42.8(C-13),54.6(C-14),23.0(C-15),28.3(C-16),55.7(C-17),12.1(C-18),16.3(C-19),40.4(C-20),21.1(C-21),135.1(C-22),132.0(C-23),42.8(C-24),33.1(C-25),20.0(C-26),19.7(C-27),17.6(C-28)。以上数据与文献[20]报道基本一致,化合物12 鉴定为β-麦角甾醇。

本研究从亚麻叶白千层植物内生真菌Penicillium citrinumYMY-1 乙酸乙酯提取物中分离鉴定出12个化合物,主要为聚酮和生物碱类成分,其中化合物4 和8 为首次从青霉属真菌中分离得到。经文献检索发现,化合物1 和2 具有抗肿瘤活性[10,17];
化合物3、5 和6 对乙酰胆碱酯酶具有抑制活性[14,21];
化合物7、9 和10 具有抗菌活性[15,22];
化合物8 具有抗炎活性[16]。本研究结果不仅丰富了青霉属真菌的化学成分多样性,亦为该真菌的进一步开发利用提供了一定的实验依据。

猜你喜欢 柱层析青霉硅胶 1起ICU耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌感染暴发的流行病学调查传染病信息(2022年2期)2022-07-15无线光电鼠标五金科技(2020年4期)2020-09-23泥炭组成成分的GC-MS分析吉林农业(2019年6期)2019-06-11小蜡叶民间药用物质基础提取模式探索教育教学论坛(2018年38期)2018-09-25柱层析用硅胶对羌活中主要成分的影响中成药(2017年10期)2017-11-16厚朴酚中压硅胶柱层析纯化工艺的优化中成药(2017年4期)2017-05-17自体耳软骨移植联合硅胶假体置入在鼻部整形中的应用中国医疗美容(2015年4期)2015-04-27碳青霉烯类抗生素耐药机制的研究进展中国当代医药(2015年26期)2015-03-01三种方法联合检测在非HIV感染儿童马尔尼菲青霉病的临床应用现代检验医学杂志(2015年4期)2015-02-06产IMP-1型碳青霉烯酶非脱羧勒克菌的分离与鉴定现代检验医学杂志(2015年2期)2015-02-06

Tags: 真菌   亚麻   代谢  

搜索
网站分类
标签列表