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层析柱装柱流程
2022-08-03 15:25:03 ℃下面是小编为大家整理的层析柱装柱流程,供大家参考。
BPG300 层析柱标准装柱流程规范 SOP-BPG-001
操 作 标 准
目的:为了使 BPG300层析柱装柱过程可重复,并能够得到较好的柱效,故建立此
操作规范。
范围:配合 ?KTA process 系统进行有效的蛋白质纯化操作。
责任人:层析工序操作人员
标准操作程序:
1 基本术语概念
填料因子( Packing Factor, PF):指在在装柱过程中,用低流速(如 60cm/h)
对填料进行沉降压缩得到的调料高度和最后装柱完成时填料高度(柱高)的比
值,
GEHC 生产的各种常见填料的 PF 参见《 GEHC AxiChrom 300-1000 columns User
Manual 28-9562-89 Edition AA 》;
线性流速( linear flow rate):单位时间内液体流经的直线距离,常用 cm/h 表
示;
体积流速( volume flow rate):
单位时间内液体流经的空间容积,常用 ml/min
表示;
1
BPG300 层析柱标准装柱流程规范 SOP-BPG-001
换算:
2 准备工作
2.1 检查层析柱的完整性,所带配件,是否水平(用水平仪矫正) ,是否清洁
(如有污染应进行清洗) 。
2.2 确定所用填料及其特性、浓度等
以 DEAE SepharoseFast Flow 填料为例,其填料因子( PF)为 1.15,新填料
(slurry)浓度为 75%(保存于 20%乙醇中),耐压 3bar。
2.3 确定放大后的工艺参数
以 XX 生化制药股份有限公司的放大工艺为例,
中试工艺参数:
柱高 h=10cm;
体积流速 v1=3ml/min;
柱内径 d=1.6cm.
即,线性流速 v2=v1/s 柱=3/(3.14 ×0.82) cm/min=1.5 cm/min;
样品与填料接触时间 t=h/v2=10/1.5min=6.67min;
在工艺的线性放大中 h、v2 和 t 均不变,则可保证样品出峰的位置(洗脱时间)和形
状不变。
使用 BPG300层析柱进行放大的工艺参数:
装柱体积 V 柱= S柱 h=3.14×1.52×1L=7L;
装柱需要 slurry 体积 Vslurry=V 柱×PF/Cslurry
以 DEAE Sepharose Fast Flow为填料,
则,Vslurry=7×1.15/0.75L=10.73L;
装入柱中的 slurry 高度 Lslurry=Vslurry/S柱=10.73/(3.14 1×.52)dm=1.52dm=15.2cm.
3管路安装
3.1 层析柱管道和配件安装
3.1.1 卸下柱子顶部和底部的盲堵垫圈,旋松密封调节器,用纯水或 20%乙醇
充分浸润柱内壁和柱头 O 型圈;
3.1.2用扳手对称卸下支持杆连接到法兰的螺丝,并通过旋转高度调节手柄将柱
头旋至最高处,在柱头顶部依次安装压力表和四路二通阀,在柱底安装四路二
2
BPG300 层析柱标准装柱流程规范 SOP-BPG-001
通阀;
3.1.3 在顶部四路二通阀上横向连接一根细管,另一端连至 ?KTA process上端
连接口 COLUMN TOP,同时从柱底四路二通阀横向接出一根细管至 ?KTA
process的下端连接口 COLUMN BOTTOM 。
图 1、BPG300 层析柱安装示意图
3.2层析柱下端筛网排气泡
3.2.1连接两根足够长的细管到 ?KTA process进样泵的 A1 和 B1 进口,两管另
一端均放入纯水中;
3.2.2 从 A1 泵入纯水:打开 UNICORN 软件,在 system control 窗口点击
manual→valves→InletA ,选择 inletA1 ,insert;
InletB,选择 closed,insert;
3
BPG300 层析柱标准装柱流程规范 SOP-BPG-001
Column,选择 upflow,insert;
Pump→Flow,设定流速 60L/h,点击 execute运
行程序充水至 BPG 柱中 2-3cm 左右,pause,清除下端筛网中的空气,用注射
器吸出筛网中残留的气泡。
4装填料
4.1准备填料
所用填料为 DEAE Sepharose Fast Flow ,装置的是保存于 20%乙醇中的新
slurry;
4.2 卸下柱头,用搅拌棍引流加入混匀的 slurry 至 15.2cm 处,再加入纯水至
40cm 左右,充分搅拌混匀,同时避免挤压筛网和柱壁,静置使填料界面至少
低于 38cm;
4.3 在 system control 窗口点击 manual→valves→InletA,选择 inletA1,insert;
InletB,选择 closed,insert;
Column,选择 downflow,insert;
Pump→Flow,
设定流速 60L/h,点击 execute运行程序将柱头上端筛网充满水以除去气泡,再
装上柱头,用密封调节器固定柱头,拧紧螺丝;
4.4 在 system control 窗口点击 manual→Pump→Flow ,设定流速为 42L/h
(60cm/h),进行填料的沉降,待填料高度降至 14cm左右,将密封调节器旋至
全松,将柱头快速调至距离填料 3-4cm 处,将密封调节器旋至半松,将柱头快
速调至滤网距离填料 1-2cm,旋紧密封调节器,再设定高流速(如 150L/h),
继续压缩填料,最后再调节柱头至 10cm。整个过程一直有流速,泵速不能停。
5 柱效测定
4
BPG300 层析柱标准装柱流程规范 SOP-BPG-001
图 2、 柱效测定示意图
5.1 平衡
将 A1 接口细管放入 0.4M NaCl 溶液中,将柱顶端四路二通阀调至管路与大
气相连状态,在 system control 窗口点击 manual→valves→InletA,选择 inletA1,
insert;
InletB,选择 closed,insert;
Column,选择 downflow,insert;
Pump→
Flow,再设定高流速(如 150L/h),点击 execute运行,排气泡,再将阀调至管
路与柱头相连状态,平衡 3-5 个柱体积至电导曲线稳定,点击 END;
5.2上样
5.2.1将 B1 接口细管放入 2M NaCl 溶液,柱顶端四路二通阀调至管路与大气相
连状态,在 system control 窗口点击 manual→valves→InletA,选择 Closed,
insert;
InletB,选择 InletB1,insert;
Column,选择 downflow ,insert;
Pump
→Flow,设定高流速( 150L/h)点击 execute运行,排气泡, pause;
5.2.2 在 system control窗口点击 manual→Other→End_Timer,选择 Acc. V olumn,
Timeout 设上样量为 70mL(1%柱体积);
Pump→Flow,设定上样流速 60L/h,
点击 execute的同时将柱顶端四路二通阀调至管路与柱头相连,完成上样;
5.3 洗脱
5
BPG300 层析柱标准装柱流程规范 SOP-BPG-001
5.3.1 将柱顶端四路二通阀调至管路与大气相连状态,在 system control 窗口点
击 manual→valves→InletA ,选择 inletA1,insert;
InletB,选择 closed,insert;
Column,选择 downflow ,insert;
Pump→Flow,设定高流速( 150L/h)点击
execute 运行,排气泡,同时将管路充满 0.4M NaCl 溶液,调流速至 21L/h
(30cm/h);
5.3.2 待流速稳定后,在 system control 窗口点击 manual→valves→Injection
Mark,insert,点击 execute的同时将柱顶端四路二通阀调至管路与柱头相连,
开始洗脱,在一个柱体积左右,电导检测下将产生目的峰。
5.4 测柱效
在 Evaluation 窗口中,选择实验保存的结果,在结果图中点击鼠标右键,选
择 Properties,点击 Clear,并选中 Cond_102,点击 OK。回到 Evaluation 窗口,
选择积分按钮,在弹出窗口中,选择 Cond_102,peak window 中调整积分的范
围,并在 Reject Peaks中,填 Peak must be one of 1 largest;
确定后,在积分结
果窗口,点击右键,选择 Properties,在 peak table 选项中,勾选 Plate Height
(HETP)和 Asymmetry。确定后即可计算得到计算理论塔板高度 HETP 和对
称因子 As。
6
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1 When calculating the amount of media to be packed use the Compression Factor
1.1 instead of the Packing Factor above which is used during packing.
7
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