朱晓路，陈文博，王玉玲，贾国超

郑州工程技术学院（郑州 450044）

富含酚类抗氧化剂的植物和食品，特别是水果、蔬菜和谷物被广泛研究，因为它们在降低人类慢性和降解性疾病风险方面起着关键作用。花青素，作为天然食品着色剂已使用多年，广泛应用于营养补充剂、功能性食品配方成分及药物成分等方面[1]。花青素是一类黄酮类化合物，由水溶性色素组成，可使花卉、水果、谷物和蔬菜等呈现红色、蓝色和紫色，如葡萄、蓝莓、黑加仑、覆盆子、山楂、桑葚、黑豆、黑米、紫薯和紫甘蓝等物质中都含有丰富的花青素[2]。花青素的结构特征性很强，以1个苯环、1个含氧三碳杂环和1个苯环结合而成，是典型的C6—C3—C6骨架结构，其母核结构是2-苯基苯并吡喃阳离子，稳定性较差，在C3，C5和C7位上极易发生羟基取代反应，故在自然界中几乎不存在游离的花青素，通常情况下与糖结合形成花色苷。花青素种类丰富，对人体健康非常有益，与金属离子作用机制多样化，如在调节铁代谢方面，抑制铁调素的表达。由于花青素在食品工业中的重要性，了解其提取纯化方法，以及与金属离子的相互作用具有一定意义。

1.1 食品原料中花青素的组成

花青素广泛存在于开花植物（被子植物）的花、果实、茎、叶、根器官的细胞液中，分布在27个科、72个属的植物中，其在植物中的含量和种类随着食品类别、品种、季节、气候等的不同有很大的差别，且通常与糖结合形成花色苷，结合的糖主要有葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、己糖和半乳糖等。花色苷中的糖苷基和羟基还可以与羧酸及其衍生物发生酰基化反应，如草酸、乙酸、丙二酸、苹果酸、P-对香豆酸、咖啡酸等，酰基化的花色苷稳定性相对较高[3]。花色基元的结构及其共轭糖苷和酰基的结构、位置和数量决定花青素种类的多样性，已发现的花青素及其衍生物有600多种。

Willemse等[1]通过MSE、MS/MS分析多种食品原料中的花青素组成，如表1，蓝莓和黑豆中花青素主要以花青素-3-O-单糖苷形式存在，且花青素种类繁多，包括锦葵色素、芍药色素、牵牛花色素、矢车菊素和飞燕草素等；
而红葡萄皮中则含有多种酰基化衍生物，这些化合物分别由相应的花青素与乙醛和丙酮酸等反应形成，这可能与葡萄发酵和葡萄酒陈酿有关。衍生化的花青素极性降低，因此在Hilic中的保留率低于天然花青素。紫甘蓝中发现10余种花青素成分，值得注意的是，紫甘蓝中花青素种类只有矢车菊素衍生物，区别只在于糖基的数量和酰化基团的类型和数量，形成了多种不同的矢车菊素-3-二/三葡萄糖苷-5-葡萄糖苷酰基化模式。红心萝卜中的花青素主要是天竺葵色素-3-二葡萄糖苷-5-葡萄糖苷的酰化衍生物，主要取代基是-对香豆酰基、-阿魏酰基和-丙二酰基。娄秋艳[4]利用高效液相色谱-质谱联用，分析黑米中的花青素组成，主要包括矢车菊素-3, 5-二葡萄糖苷、矢车菊素-飞燕草素-己糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-芸香糖苷、芍药素-3-葡萄糖苷、芍药素-3-芸香糖苷，其中矢车菊素-3-葡萄糖苷为主要成分，含量约占81.99%。李甘[5]分析紫洋葱的花青素组成，包括矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3, 5-O-二葡萄糖苷、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷、飞燕草素-3, 5-O-二葡萄糖苷。不同的食品原料中花青素组成有很大差别，同一类的食品原料也因为品种及生长环境等条件的影响不尽相同。

表1 5种食品中花青素的组成

1.2 花青素的主要功能活性

花青素属于生物类黄酮物质，而黄酮物质做主要的生理活性功能是自由基清除能力和抗氧化能力。花青素本身易氧化，然而容易被氧化的化合物通常是最好的抗氧化剂，这是因为其能够提供自由电子或氢供反应自由基。据研究，食品原料的抗氧化活性与花青素的含量存在线性相关性且成正比，花青素和花青素糖苷的抗氧化活性高于维生素C和维生素E。王燕等[6]采用FRAP法、ABTS法和DPPH法测定紫鹃茶花青素的抗氧化能力，在研究浓度范围内，紫鹃茶花青素的总抗氧化能力、清除ABTS+自由基和DPPH自由基的能力均与其浓度呈正相关，且通过对比得出能力均强于VC。童丹等[7]采用DPPH自由基法测定定西地产“黑美人”马铃薯中花青素的抗氧化能力，花青素含量越高，DPPH自由基清除率越高，抗氧化活性越强。

花青素优秀的抗氧化能力使其具有抗疲劳衰老、抗肿瘤、抑菌、调节脂肪代谢、糖类代谢和肠道菌群等多种功能，其抗氧化机制主要表现在：减少活性氧积累和清除自由基、减少DNA损伤、激活酶抗氧化系统以及与金属离子发生作用等[8]。Chen等[9]从黑米中提取的花青素对癌细胞有抗转移作用，具体表现为对AP-1的DNA结合活性和核转位有抑制作用，在体内对SKHep-1细胞的生长有抑制作用。胆管癌与麝猫后睾吸虫感染有关，矢车菊素和飞燕草素糖苷提取物与姜黄结合形成花青素复合物，针对感染麝猫后睾吸虫的仓鼠进行试验，结果表明，复合物增加自由基清除能力，降低炎症，抑制氧化/硝化应激反应，减少肝损伤和导管周围纤维化[10]。

2.1 食品中花青素的主要提取方法

溶剂萃取法一直是最常用的一种提取方法，可以从水果、蔬菜等食品原料中提取多种化合物，包括黄酮类化合物。花青素是极性分子，因此提取花青素的溶剂通常包括甲醇、乙醇、醋酸酸化水、盐酸介质中的乙醇和丙酮水溶液[11]。这些方法意味着需要后续纯化以去除同时被提取出的非酚类物质（如糖、有机酸和蛋白质等），如固相萃取法。溶剂的类型、浓度、体积、温度、提取时间和提取方法等因素对提取率有显著影响，这些因素的组合和最佳条件的确定非常重要[12]。

在酸化溶剂萃取中，应特别注意避免使用强酸介质，因为酰基化花色苷可能会降解，如果是3-单苷花青素，糖苷键可能会被破坏[13]。为了提取酰基化花青素和3, 5-二甘醇，有必要使用弱酸介质（甲酸或乙酸）避免其水解，当使用弱酸介质时，可能提取出更多不同的花青素[11]。最常用的萃取剂是酸化甲醇或乙醇，酸性甲醇提取最有效，提取能力要优于酸性乙醇，然而，在食品工业中，乙醇和有机酸更可取，因为它们比甲醇和盐酸的毒性相对小一些；
且乙醇提取过程中可以同时除去果胶蛋白和淀粉等杂质。王凤娟[14]对比去离子水、0.1%盐酸、甲醇、乙醇、酸性乙醇、酸性甲醇、丙酮对红菊苣中花青素的提取率，结果表明，红菊苣花青素提取的最佳溶剂是酸性甲醇，但是考虑到食品安全性问题，试验最终选择了酸性乙醇作为后续提取溶剂。浸泡法也被广泛应用于花青素提取，尤其是葡萄酒行业，将新鲜葡萄进行研磨，使葡萄汁与皮一起浸泡以提取色素[15]。

除了溶剂的选择，一些辅助方法的使用可以提高花青素提取效率，如超声波提取法、超临界CO2提取法、酶法处理提取、微波辅助提取法及组合使用方法等。张诗卿等[16]优化酶-超声波法提取桑葚中花青素的工艺参数，确定超声波的最佳提取功率为180 W，纤维素酶的最佳添加量为8 mg/g。曾琳等[17]采用浸提法、超声波辅助法及微波辅助法提取黑米中的花青素，微波辅助法提取花青素的稳定性最强；
而超声波辅助法提取花青素的效率最高，但稳定性最弱；
浸提法提取的花青素稳定性介于二者之间，但提取率最低。杨萍等[18]利用微波辅助和有机溶剂相结合提取黑枸杞中的花青素，确定最佳微波时间116 s、微波功率146 W。超声波法经常被用于提取芳香物质、多糖、多酚等，在液体中，超声波会闭合并激发出瞬间强压力，产生强烈的扰动效应、空化效应等多级效应，增加溶剂的穿透力，使植物细胞受压破裂，快速融出细胞中所要提取的目标物，有效缩短提取时间。常规浸提法的提取效率相对较低，因其难易打破原料内部结构，仅可提取出浅表的目标物，造成提取不彻底。微波辅助技术有操作简便，提取速度快，提取效率高和溶剂可循环利用，减少污染物排放量，改善生产环境等特点。

2.2 花青素提取物的主要纯化方法

现有提取方法对花青素没有选择性，因为所用溶剂在提取出花青素的同时能够提取大量其他的化合物，如糖、蛋白质或有机酸。因此，有必要实施后续新的纯化技术，以分离出要研究的目标花青素。

从上述目的出发，各种各样的技术被用于花青素的分离纯化，从简单的固相萃取（SPE）和液液萃取（LLE）到复杂的色谱技术，如高速逆流色谱法（HSCCC）、中压液相色谱（MPLC）、和高效液相色谱（HPLC）等。SPE通常在含大孔吸附树脂、C18或交联葡聚糖（Sephadex）柱子中进行，其中花青素通过其羟基与填料紧密结合，通过添加不同极性的溶剂来实现花青素与其他化合物的分离。大孔吸附树脂是20世纪60年代以来发展起来的有机高聚物吸附剂，具有很好的吸附性能。由于吸附量大、成本低、效率高、可再生等优点，近年来被广泛应用于不同类型植物中花青素的富集分离纯化。AB-8型大孔吸附树脂被多方认证为常用最佳吸附树脂之一，作为弱极性的树脂，在吸附过程中，AB-8大孔吸附树脂易和色素形成氢键，使它们之间的结合更加牢固[14,19-20]。HSCCC和MPLC用作纯化方法，通过高效液相色谱法进行结构分析，LC-MS/MS进行组分结构鉴定，优点是最大限度地减少分离纯化时间和流动相溶剂的使用量，效率相对较高，精确度高。高效液相色谱法检测花青素最常用的检测器是紫外-可见光检测器和二极管阵列检测器。

各种纯化技术既可以是独立存在，同时又是相辅相成的，2种或多种技术相结合达到的效果通常是1+1＞2，可以分离得到更高纯度的花青素单体。Zou等[21]运用高速逆流色谱分离从草莓提取物中分离出3种花青素，经鉴定为天竺葵素-3-芦丁苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷和天竺葵素-3-葡萄糖苷，纯度分别达到95.6%，96.2%和99.3%。Yao等[22]采用柱层析和高速逆流色谱相结合的方法，从桑树果实中分离出高纯度的花青素单体。使用Amberlite XAD-7HP柱子和80%乙醇（0.1% HCl）纯化得到纯度为68.6%的花色苷混合物，后采用正丁醇∶甲基叔丁基醚∶乙腈∶水∶三氟乙酸（30∶10∶10∶50∶0.05，V/V）双相溶剂体系的高速逆流色谱法分离得到飞燕草素-3-O-芸香苷、矢车菊素-3-O-芸香苷和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷3种花青素单体，并通过核磁共振和液相质谱联用进行鉴定。郭丹妮等[23]将蓝莓粗提取先经过葡聚糖凝胶色谱初步分离，得到花青素粗提液，经过高速逆流色谱分离得到纯度分别为65.0%和90.0%的2种花青素。Zhang等[24]通过柱层析和半制备HPLC技术相结合，从紫色甘薯中分离出两种高分子量酰化单体花色苷。

花的颜色的多样性最初解释是金属离子和花色基元黄洋盐之间形成螯合物的缘故。在金属-花青素络合物中，Mg2+与飞燕草苷型花青素络合可以形成蓝色；
而对矢车菊素-花青素形成蓝色起重要作用的是与Fe3+；
绣球花的蓝色涉及非黄酮类与Al3+的络合；
桔梗的蓝色花瓣也可能是通过分子内和分子间的堆积以及极少量的金属离子的存在[25]。尽管早期人们对花青素-金属络合物在食品工业中的应用研究较少，但是这个相互作用却为保持颜色的稳定性提供了积极的可行性方案，特别是当所含的金属对健康无害，甚至是饮食中必需矿物质的一部分。不同的花青素在同一种金属离子作用下反应不尽相同；
同一种花青素在不同金属离子作用下反应也不相同。金属离子在水中会分解出酸，使溶液呈酸性，花青素在不同pH条件下呈现不同的颜色，因此金属离子的加入可以改变花青素的颜色。一些金属离子的加入，能够有效提高花色苷的稳定性；
也有部分金属离子可以和花青素发生螯合作用生成螯合物[26]。

一些关于植物颜色稳定性的研究表明，蓝色是由于花青素与一些金属如铝、铁、铜和锡之间的络合作用。花青素在B环上如果有临位羟基（如Cy、Dp、Pt），可以和铁、钙、铜、铝等金属离子发生络合反应形成花青素-金属络合物。根据此特征，通过向花青素溶液中加入金属离子，观察其紫外吸收光谱的变化，可以判断该类花青素B环是否有临位羟基。金属离子的浓度、作用对象和pH环境等的不同，其颜色的保护效果和稳定性也不一样[27]。笃斯越橘果实花青素提取物在pH 3.0条件下，对Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Al3+均表现了一定的稳定性[28]。Na+、Mg2+、K+、Ca2+、Zn2+对紫甘蓝花青素水提液的颜色稳定性没有产生显著影响；
Al3+对紫甘蓝花青素提取液有明显增色作用；
Fe3+能直接使提取液变色；
Fe2+、高浓度Cu2+则对紫甘蓝花青素有明显褪色作用[29]；
而童丹对马铃薯花青素的研究中显示Mg2+、Ca2+对色素的破坏作用较大[7]。张亦竹等[30]研究发现，一定质量浓度（0.2 g/L）Zn2+的加入有助于提高圆茄子皮花青素的提取率。不同的是，张艳晖等[31]研究发现，Zn2+、Cu2+降低了紫色番茄花青素提取量，Ca2+、Mg2+、Na+、Mn2+、Al3+在提取过程中有保护和提高花青素提取量的作用。

近几年，随着越来越多种类花青素的发现，其作为天然色素在各种产品中的研究与应用显著增加。考虑到此类色素对健康的有益影响，将其纳入食品和饮料行业具有重要价值。了解花青素分类、提取纯化和鉴定方法，以及与金属离子的相互作用对于花青素在工业中的应用有重要的理论指导作用。富含花青素的原料的多样性，花青素本身及衍生物的多样性，为人们提供更多的研究和探索空间；
不断地优化花青素生产加工工艺，将为着色剂在实验室和工业生产中控制成本方面提供科学方法；
同一种金属离子对不同食品原料中的花青素的提取率和稳定性有的表现促进作用，也有表现为抑制作用。国内主要研究金属离子对花青素稳定性的影响，对于其作用机制和原理少有报道。随着科学技术的发展，天然色素的提取、分离、鉴定和应用在食品工业中会有更大的发展前景。

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