楼天灵，袁莉霞，张国芳，吴 浩，沈 岚

(1.浙江药科职业大学，浙江 宁波 315100; 2.宁波市农业科学研究院，浙江 宁波 315100)

铁皮石斛(Dendrobiumcandidum)是多年生草本植物，属于兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)，是一种传统的名贵中草药。其具有益胃生津、滋阴清热之功效，富含多糖及几十种微量元素，素有“千金草”“神仙草”之称[1]。近年来，通过药理及有效成分分析发现，铁皮石斛中的有效成分主要为多糖类物质，能提高免疫力，降低血糖，抗氧自由基及保护胃等功效[2]。随着中药在临床用药中的增加，野生资源的过度开采，野生资源蕴藏量显著下降，难以满足加工和临床使用的需求。人工种养规模和产区范围随之均逐步扩大，药材质量不稳定、品种退化问题也随之严峻。因此，筛选培育优良种源，扩大新的药源迫在眉睫。而植物物种间的遗传亲缘关系越接近，其所含的化学有效成分类型及含量也越相近[3]，能较快地发现新药源[4]。但目前有关铁皮石斛的研究主要集中于药理药效、有效成分分析等方面[5-6]，系统发育方面的研究较少。

叶绿体在植物细胞中起着至关重要的作用，能进行植物的光合作用，具有一套自主的遗传物质，有研究表明，其源于内共生蓝藻[7]。大量研究表明，多数被子植物的叶绿体基因组为双链环状四分体结构[8]，大单拷贝区(Large Single Copy Region, LSC)、小单拷贝区(Small Single Copy Region, SSC)和反向重复区(Inverted Repeat Regions, IRa/IRb)。叶绿体基因组较核基因组及线粒体基因组更为保守，其长度在120～160 kb之间，总基因个数约为130个[9]，具有单亲遗传不存在重组、序列变异度适中等特点[10]。近年来，随着高通量测序的发展，叶绿体基因组的研究也越来越多，自1986年烟草[11]和地钱[12]首次公布以来，已有超3 000条叶绿体基因组被公布[13]。

本研究基于Illumina二代测序技术及生物信息学方法，分析了铁皮石斛的叶绿体基因组全序列测序、基因功能注释、图谱构建，并对其结构特征作出解析。选取了已发表的13个兰科植物以及2个外类群叶绿体基因组序列，做了亲缘关系分析，为铁皮石斛的药用资源开发、遗传多样性、种间系统亲缘关系及新药源的开发等研究奠定理论基础。

1.1 材 料

铁皮石斛样品采集自宁波市宁海县小宋村1个野生居群，由浙江省宁波市农业科学研究院沈岚高级农艺师鉴定。标本存放于浙江省宁波市农业科学研究院石斛种质资源库中。

1.2 DNA提取

取鲜嫩幼叶约2 g，液氮冷冻研磨至粉末，利用植物基因组DNA提取试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)，参照说明书完成提取。根据1.5%的琼脂糖凝胶电泳的条带亮度及Nanodrop 1000检测的D260/D280的比值和浓度，经检验合格的样本送生工生物工程(上海)股份有限公司，通过Illumina HiSeq 2500-PE 150平台进行建库测序。

1.3 叶绿体基因组测序

DNA质量检测合格后，通过超声波的方法将其破碎，纯化并修复破碎的DNA片段，完成3′-端加ployA处理，连接测序头[14]，并利用1.5%的琼脂糖凝胶电泳，区分不同大小的片段，完成PCR扩增。通过基因文库质检，获得基因测序文库。经检测合格的文库利用Illumina Hi Seq 2500完成基因测序。

1.4 基因组组装及基因功能注释

对Illumina测序获得的原始测序文件数据进行过滤，利用NGS QC ToolKit[15]除去测序接头以及低质量的片段，尽可能保证序列的准确性，获得高质量的测序结果。采用NOVOPlasty软件[16]，设定K-mer值为39，参考兰科石斛属石斛Dendrobiumnobile(Genebank No.：KX 377961.1)的叶绿体基因组(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KX 377961.1/)的保守序列对铁皮石斛的叶绿体基因组进行组装，获得完整的叶绿体基因组。得到的叶绿体组基因用Mitofy[17]完成基因功能注释并利用CpGAVASpipeline[18]进行准确性验证。最后再利用在线工具OGDraw[19](https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html)绘制铁皮石斛的叶绿体基因组物理图谱，并上传至NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)，获得登录号(MZ 129032)。

1.5 重复序列与SSR序列分析

利用在线软件REPuter[20](https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/reputer)验证铁皮石斛的重复序列：正向重复序列(F)、反向重复序列(R)、正向互补序列(C)和回文序列(P)，参数设置为：Minimal repeat size=30，Hamming distance=3；
以及利用在线软件MISA[21](http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)检测简单重复序列(SSR),设置参数为：单核苷酸重复≥10，二核苷酸重复≥5，三核苷酸重复≥4，四核苷酸重复≥3，五核苷酸及六核苷酸重复≥3。所有搜索得到的序列结果均通过人工予以验证。

1.6 叶绿体全基因组比对分析

利用在线软件VISTA[22](http://genome.lbl.gov/vista/mvista/instructions.shtml)中的mVISTA工具对铁皮石斛及石斛属的其他3个物种(霍山石斛Dendrobiumhuoshanense、细茎石斛Dendrobiummoniliforme、石斛Dendrobiumnobile)的叶绿体全基因组进行对比分析并绘制比对图。

1.7 系统发育分析

为了解铁皮石斛在兰科植物中的系统位置，从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库中下载了13个已发表的兰科叶绿体基因组，2个百合科植物(外类群)，分别为：长距虾脊兰(CalanthesylvaticaNC 044633)、通麦虾脊兰(CalanthegriffithiiMZ 474966)、伏生石豆兰(BulbophyllumreptansMW 800884)、杜鹃兰(CremastraappendiculataNC 037439)、霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseMN 617016)、细茎石斛(DendrobiummoniliformeMN 617018)、石斛(DendrobiumnobileKX 377961)、沼兰(LiparisjaponicaMK 886513)、箬叶兰(SobraliacallosaKM 032623)、疏花火烧兰(EpipactisveratrifoliaNC 030708)、大叶火烧兰(EpipactismaireiNC030705)、日本对叶兰(NeottiajaponicaMH 321184)、小叶兜兰(PaphiopedilumbarbigerumNC 050870)，蒜(AlliumsativumMK 335928)、韭(AlliumtuberosumNC 044709)，与铁皮石斛叶绿体基因组，通过MAFFT软件[23]完成基因组序列的比对，再利用MEGA 7.0软件[24]构建系统进化关系，确定铁皮石斛与其他兰科植物之间的亲缘关系。

2.1 铁皮石斛叶绿体基因组基本特征

通过Illumina Hi Seq 2500平台获得6.98 GB的高质量测序数据，铁皮石斛叶绿体基因组结构与大多数被子植物类似，为双链环状的四分体结构(图1)，其大小为153 508 bp，大单拷贝区域(LSC)为85 759 bp，小单拷贝区域(SSC)为14 973 bp，两个反向重复区域(IRs)为26 419 bp。

在铁皮石斛叶绿体基因组中共被注释了133个基因，其中包括93个蛋白编码基因(CDS)，32个转运RNA(tRNA)基因以及8个核糖体rRNA(rRNA)基因(表1)。并对其碱基组成进行分析，发现GC的含量占总共碱基数量的37.51%，其中LSC区域对应的百分比为35.13%，SSC区域对应的百分比为30.24%、IRa区域对应的百分比为43.35%和IRb区域对应的百分比为43.35%。

表1 铁皮石斛叶绿体基因组结构特征Table 1 Structural characteristics of Dendrobium candidum chloroplast genome

2.2 重复序列分析

本研究利用在线软件REPuter检测了长重复序列(长度≥30 bp)，铁皮石斛共检测到47个长重复序列，其中正向重复序列19个，反向重复序列20个，互补重复序列8个，其间隔序列大小均在30～50 bp之间(表2)。利用在线软件MISA检测铁皮石斛叶绿体基因组中简单重复序列(SSR)，共检测到简单重复序列63个，其中单核重复序列(A/C/T/G)36个，二核苷酸重复序列(AT/GA/TA/TC)15个，三核苷酸重复序列(ATA/TAG/TAT)5个，四核苷酸重复序列(AGAA/ATTA/CTAT/GTCT/TAGT) 5个，五核苷酸重复序列(TCTAT)1个、六核苷酸重复序列(TCCATC)1个(表2、表3)。

表2 铁皮石斛叶绿体基因组中长重复序列与SSR数量Table 2 The long repetitive sequences and SSR numbers of Dendrobium candidum chloroplast genomes 单位：个

表3 铁皮石斛叶绿体基因组中SSR类型Table 3 SSR types of Dendrobium candidum chloroplast genomes

图1 铁皮石斛完整的叶绿体基因组图谱Fig.1 The whole chloroplast genome map of Dendrobium candidum

2.3 叶绿体全基因组比对分析

以已注释的铁皮石斛叶绿体基因组序列(登录号: MZ 129032)为参考，再通过在线软件工具 mVISTA 对铁皮石斛及石斛属的其他3个物种的叶绿体基因组进行全基因组比较分析，结果(图2)显示4个叶绿体基因组均具有高度保守序列，且大部分变异均处于非编码区。

图2 霍山石斛、细茎石斛、石斛及铁皮石斛的叶绿体基因组全局比对Fig.2 Global comparison of D. huoshanense, D. moniliforme, D. nobile and D.candidum chloroplast genomes

2.4 系统发育分析

利用MAFFT软件对从NCBI数据库中发表的15个叶绿体基因组完成基因组与铁皮石斛基因组序列的比对，再通过MEGA 7.0软件构建系统进化树。结果显示，铁皮石斛与霍山石斛、细茎石斛、石斛成一簇，其中与石斛亲缘性最近(图3)。

图3 基于16个叶绿体基因组构建的进化树Fig.3 The evolutionary tree contructed based on 16 chloroplast genomes

铁皮石斛是珍贵的中药材，药用价值与经济价值高。铁皮石斛自然条件下种子与真菌共生才能萌发，加上近年的过度采挖，导致野生石斛濒临灭绝，人工栽培面积逐步扩大，为保证种源的品质及稳定性，已有研究人员通过EST-SSR[25]、ISSR[26]、SRAP[27]、TRAP[28]等分子手段为保证铁皮石斛的品质提供了一定的参考。本研究通过叶绿体基因组的发育关系分析铁皮石斛种间系统亲缘关系，对上述研究进行进一步补充。基于Illumina高通量测序及生物信息学方法分析了铁皮石斛叶绿体基因组全基因，研究结果显示，与大多数被子植物类似，为双链环状的四分体结构，大小为153 508 bp，共编码133个基因(93个CDS基因，32个tRNA基因以及8个rRNA基因)，其结果符合被子植物叶绿体规律，编码基因约为130个[9]。GC的含量占总碱基数量的37.51%，与刘潮等[29]研究结果一致，叶绿体基因组的GC含量区间为31.0%～38.0%，在LSC区域对应的百分比为35.13%，SSC区域对应的百分比为30.24%、IRa区域对应的百分比为43.35%和IRb区域对应的百分比为43.35%，其中IRs区GC含量最高，具体表现为：IRs区>LSC区>SSC区，源于该区域rRNA基因所含的GC含量高，可能与其区域含有NADH基因有关[30]。

叶绿体遗传多样性分析对种质资源的收集具有一定的意义。叶绿体基因组中存在的长重复序列及简单重复序列在序列变异中发挥着重要的作用[31]，且因其SSR含量极其丰富、分布随机、多态性高，为母系遗传等优点，被广泛用于分子标记[32]，被用于物种遗传多样性，基因组图谱等的研究[33]。本研究利用在线软件分析，获得长重复序列47个(正向重复序列为19个，反向重复序列为20个，互补重复序列为8个)，其结果与细茎石斛[34]相一致，与石豆兰属结果[35]不一致，说明植株的亲缘性与重复序列的数量和类型存在一定的关联性。简单重复序列(SSR)63个(单核重复序列36个，二核苷酸重复序列15个，三核苷酸重复序列5个，四核苷酸重复序列5个，五核苷酸重复序列1个、六核苷酸重复序1个)，叶绿体基因组中SSR以单核重复序列和二核重复序列较多，且A/T碱基含量较高，其中单核重复序列以多聚A和多聚T重复类型较多，多聚G和多聚C重复类型较少，其符合植物叶绿体基因组SSR序列组成的规律，该研究结果与其他物种相一致[36]。所获得的重复序列为铁皮石斛遗传多样性研究提供了可选用的分子标记。

近年来，对石斛属植物利用了多种技术，包括EST-SSR[25]、ISSR[26]、SRAP[27]、TRAP[28]等，做了多项物种多样性和种间多样性的研究，但种间关系仍存在一定疑虑，基于叶绿体基因组的遗传多样性分析以及系统进化分析能够在此基础上提供更有利的证据。本研究NCBI数据库中下载了13个已发表的兰科叶绿体基因组，2个百合科植物(外类群)，通过MAFF软件进行序列的比对，利用MEGA 7.0软件构建系统进化树，确定铁皮石斛与其他兰科植物之间的亲缘关系。结果显示，铁皮石斛与霍山石斛、细茎石斛、石斛成一簇，其中与石斛亲缘性最近。本研究结果为我国铁皮石斛植物资源的保护和遗传育种提供了一定的理论依据。

猜你喜欢 叶绿体核苷酸石斛 石斛兰草堂(2022年4期)2022-11-11仙草石斛大众科学(2021年8期)2021-12-13石斛莫打粉　久煎疗效佳保健与生活(2021年19期)2021-10-15慢性乙型肝炎抗病毒治疗进展医学信息(2019年4期)2019-10-08共生课程教育研究·学法教法研究(2019年18期)2019-10-08人不吃饭行吗少儿科技(2019年9期)2019-09-10吃味精会对身体有害吗烹调知识(2019年3期)2019-03-01仙草石斛的护肤传奇中国化妆品(2018年8期)2018-12-06一种快速提取微藻完整叶绿体及其DNA的方法江苏农业科学(2016年2期)2016-04-11反相高效液相色谱—串联质谱法测定母乳及奶粉中核苷和核苷酸的含量分析化学(2014年4期)2014-10-24