车 金 ，姜 峰，陈 瑶，毕誉丹，周奕辰，姜凤华，马永春，杨鹏飞，赵永祥，陈泽良，韩小虎

（1.沈阳农业大学 重要家畜疫病研究教育部重点实验室，沈阳 110161；
2.辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁 沈阳 110161；
3.丹东市农业农村发展服务中心，辽宁 丹东 118000；
4.丹东市第六人民医院，辽宁 丹东 118002）

蜱隶属于节肢动物门（Arthropoda）、蛛型纲（Arachnida）、螨亚纲（Acari）、寄螨总目（Parasitiformes）、蜱目（Ixodides）、蜱总科（Ixodoidea），其下又包括4 个科：硬蜱科（

Ixodidae

）、软蜱科（

Argasidae

）、纳蜱科（

Nuttalliellidae

）和恐蜱科（

Deinocrotonidae

）。蜱是专性吸血的非永久性寄生虫，其生活史分为卵、幼蜱、若蜱和成蜱4 个阶段，后3 个阶段的蜱可以自由活动，且均需要吸血寄生。全球现有蜱类约900 余种，我国蜱类物种多样性较高，已报道1 25 种，其中硬蜱111 种，软蜱14 种。蜱可携带并传播多种病原体，并可经期传播，是仅次于蚊子的第二大病原传播媒介，也是家畜和野生动物病原体最重要的传播媒介。黄病毒科病毒为单股正链且不分节段的RNA 病毒，长度约为11kb，包括肝炎病毒属（

Hepacivirus

）、黄病毒属（

Flavivirus

）、瘟病毒属（

Pestivirus

）和持续性 G 病毒属（

Pegivirus

）。其中黄病毒属共有70余种病毒，包括熟知的登革病毒（Dengue virus）、流行性乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus）、森林脑炎病毒（Tick-borne encephalitis virus）、寨卡病毒（Zika virus）、黄热病病毒（Yellow fever virus）、西尼罗河病毒（West Nile virus）等。这些病毒中的大部分可通过蜱、蚊等媒介生物传播给人类、家畜及野生动物，对人类公共卫生安全构成威胁。随着对蜱、蚊等媒介生物的反向病原学的深入研究，越来越多的未知病原将会被人们所识别，并且预测其中以黄病毒科成员居多。荆门病毒（Jingmenvirus，JMV）是近年来新发现的一种RNA 病毒，与黄病毒的NS3 和NS5 基因具有同源性，主要传播媒介为节肢动物，因此被归为黄病毒科。后来通过高通量测序技术又发现了与荆门病毒基因组结构相似的病毒，包括Alongshan virus（即阿龙山病毒）、Wuhan flea virus、Mogiana tick virus及Guaico Culex virus 等。在国际病毒分类委员会对其正式命名前，这些病毒暂时被归为一个新的属，即荆门病毒属。其中除Alongshan virus外，其余病毒尚无直接导致人类感染发病的证据。

阿龙山病毒（Alongshan Virus，ALSV）是全球范围内发现的第一个感染人的分节段黄病毒，分为4 个节段，全基因组长度为11350bp。在我国内蒙古呼伦贝尔、芬兰东南部和俄罗斯均有发现，可通过蜱叮咬感染哺乳动物，并在此间循环传播。ALSV 引起新发传染病阿龙山热，主要临床症状有发热（体温38.5～39.2℃）、持续性中度头痛、乏力、恶心并伴有咳嗽、咽部不适、右侧颈淋巴结肿大疼痛、精神沉郁、肌痛、关节痛、皮疹等，目前无专门针对ALSV 感染后的特效治疗药物，只能进行对症治疗。阿龙山病毒在养殖动物和野生动物中的感染与流行情况，目前尚无系统的研究，也没有相关报道。

2018 年，本实验室在对采集自辽宁省丹东市的蜱进行宏转录组测序时，发现一种新的病毒核酸（GenBank登录号：MZ676705.1），与其亲缘关系最为接近的是阿龙山病毒（糖蛋白VP1 基因相似度为72%），尚未能人工分离得到该病毒，暂命名为新型阿龙山病毒（New Alongshan Virus，NALSV）。丹东地区蜱分布广泛，是多种蜱传病流行的热点地区，每年都有部分不明原因的发热病人未能明确病原。目前尚无确切证据表明NALSV可感染人类，但其作为一种潜在人兽共患病病原的可能性随时存在。因此，建立一种灵敏度高、特异性强、操作简便的检测方法，对蜱传病尤其是不明原因发热病人的病原学检测，以及对该病毒开展进一步的病原生态学研究都具有重要意义。

实时荧光定量PCR 技术（Quantitative Real-time PCR）具有特异性强、灵敏度高、可定量等多种优点，广泛运用于各种分子生物学检测，结果可靠且效果显著。本实验选取NALSV的糖蛋白VP1基因序列进行引物探针设计，优化反应条件，最终建立了该病毒的实时荧光定量PCR 检测方法。采用该技术对采集自辽宁及内蒙古部分地区环境中的游离蜱进行检测，结果表明该技术具有良好的实用性，同时显示NALSV 在部分地区的蜱体内具有较高的感染率，需引起足够的警惕与重视。

1.1 材料

供试NALSV 核酸来自本实验室提取的蜱核酸；
阳性对照为载有阿龙山病毒（GenBank 登录号：MH158416）、黄热病病毒（GenBank 登录号：MZ604855）、流行性乙型脑炎病毒（GenBank 登录号：DQ648597）和森林脑炎病毒（GenBank登录号：MF565480）相应序列核酸的质粒，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；
540 头蜱样本是2020～2021 年使用布旗法采集自辽宁省及内蒙古自治区的游离蜱，经形态学观察判定：采集自辽宁省内的蜱样本为草原革蜱（

Dermacentor nuttalli

）和长角血蜱（

Haemaphysalis longicornis

），采集自内蒙古自治区的蜱样本为森林革蜱（

Dermacentor silvarum

）和草原革蜱。试验采用的QuantStudio 3 实时荧光定量PCR 仪为Applied Biosystems 公司生产；
pET-28a 载体为本实验室保存；
核酸提取试剂盒、BL21 大肠杆菌表达菌株感受态细胞（

Escherichia coli

）、限制性内切酶QuickCutEcoRⅠ及QuickCutHind Ⅲ购自全式金生物技术有限公司；
逆转录试剂盒、AceQ Universal UProbe Master Mix V2 酶购自南京Vazyme 生物科技股份有限公司；
质粒小提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；
SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物及探针的设计与合成 根据宏基因组测序结果，结合NCBI上的核酸序列，选择NALSV 糖蛋白VP1基因片段，选取其保守区，根据引物和TaqMan 探针设计原则（Tm 值、GC%等），使用Primer 6.0 设计多对特异性引物，通过GenBank 数据库BLAST 进行特异性和保守性比较分析，确定NALSV 实时荧光定量PCR 检测的引物及 TaqMan 探针。上游引物：5’- TACGCATTTGCCGTCTGACC-3’，下游引物：5’- AACGGAGTCATCTGGGGGAG -3’，片段长度为126bp，探针：5’- TCACGTTGTGGTGTTGCCTGGCCGT -3’，5’端FAM 荧光素标记，3’端 BHQ1 标记。普通 PCR 上游引物：5’- CTCAACTTCCGCCGTCTC -3’，下游引物：5’- GCACCTACTACCTCGTCCC-3’，片段长度为473bp。引物探针均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 NALSV标准品的制备 蜱清洗研磨，经离心处理后，取蜱悬液上清200μL，移到1.5mL的离心管中，按照试剂盒（EasyPure Viral DNA/RNA Kit）内说明书进行核酸提取，对已经提取的RNA 按照试剂盒（Vazyme HiS-cript ⅡQRT Super Mix）内说明书进行操作，逆转录为cDNA。

取蜱核酸进行普通PCR 扩增；
将琼脂糖凝胶电泳后的PCR 产物连接到pET-28a 载体上，然后转化到BL21大肠杆菌表达菌株感受态细胞，小提质粒后利用分光光度计测量质粒的浓度为75ng·μL，计算其拷贝数。

1.2.3 反应体系的优化 以构建好的NALSV标准品为阳性模板进行实时荧光定量PCR反应，引物探针浓度的优化采用矩阵法，引物浓度从 0.1～1.0μmol·L区间每 0.1μmol·L递增，探针浓度从 50～250nmol·L区间每50nmol·L递增，根据各组所得C值以及扩增曲线形态，确定引物探针的最佳浓度及配比；
模板浓度的优化采用每20μL体系模板的加入量从1～6μL区间每1μL递增，根据各组所得C值及扩增曲线形态，确定模板的最佳浓度。

1.2.4 标准曲线的建立 以连续10倍梯度稀释的标准品为模板，所用浓度为1.0×10～1.0×10copies·μL，进行实时荧光定量PCR 反应。每个浓度的标准品设5个重复，所得结果舍去1个最大值、1个最小值，余下的3个结果取平均值。选取5组连续数据，以C值为Y轴、拷贝数的对数为X轴制作标准曲线，并计算斜率及相关系数。

1.2.5 实时荧光定量PCR方法的评价 用所建立的方法，对ALSV、YFV、JEV、TBEV进行实时荧光定量PCR检测，测试所建立方法的特异性。每组设3个重复，并用ddHO设阴性对照组。

阳性标准品用TE 缓冲液稀释到最低拷贝数（1.0×10copies·μL），采用最终优化条件进行反应，测试所建立方法的敏感性。每组设3个重复，并用ddHO设阴性对照组。

在同组实验中，使用已稀释标准品（1.0×10～1.0×10copies·μL）进行反应，计算平均C值、标准差及变异系数，测试所建立方法的重复性。每组设3个重复，并用ddHO设阴性对照组。

为分析不同时段实验数据的差异性，即实验的稳定性，每间隔1周进行1次反应，计算平均C值、标准差及变异系数。每组设3个重复，并用ddHO设阴性对照组。

选用不同浓度的NALSV 阳性标准品[（1.0×10～1.0×10）copies·μL]，进行普通PCR 反应，反应程序：94℃5min，94℃ 30s，56℃ 20s，72℃ 30s，72℃ 10min，扩增后的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。

1.2.6 蜱样本检测 蜱样本经核酸提取及逆转录后（方法同1.4），进行NALSV实时荧光定量PCR检测。

2.1 标准品的制备

测得的OD/OD为1.8～2.1，所得的NALSV标准品浓度为75ng·μL，经计算得出NALSV标准品拷贝数为1.17×10copies·μL，阳性标准品用TE缓冲液进行连续10倍梯度稀释（10～10copies·μL）。

2.2 反应条件的优化

通过引物探针浓度的配比以及模板浓度的筛选（图1 和图2），优化后的反应体系为：AceQ Universal UProbe Master Mix V2 混合液 10μL，探针（10nmol·L）0.5μL，上、下游引物（10nmol·L）各 0.6μL，cDNA 模板3μL，ddHO 补足至 20μL；
优化后的反应条件为：95℃ 5min，95℃ 10s，58℃ 30s，45 个循环，于58℃时收集荧光信号。

图1 NALSV引物探针浓度优化Figure 1 Primer probe concentration optimization for NALSV

图2 NALSV模板浓度优化Figure 2 Template concentration optimization for NALSV

2.3 标准曲线的建立

取8个不同浓度的标准品（1.0×10～1.0×10copies·μL）为实时荧光定量PCR反应模板，采用优化后的反应条件进行实验，选取5个连续梯度的标准品（1.0×10～1.0×10copies·μL），以实验所得C值为Y轴、对应的各阳性质粒拷贝数的对数为X 轴制作标准曲线（图3），得出NALSV 标准曲线斜率为-3.4436，反应的相关系数

R

为0.9999，其标准方程为

y

=-3.4436

x

+33.063，表明所建立的方法相关性良好（图4）。

图3 梯度浓度为1.0×109 ～1.0×102copies·μL-1的NALSV实时荧光定量PCR扩增图Figure 3 Real-time qPCR amplification image of NALSV with gradient concentration of 1.0×109-1.0×102copies·μL-1

图4 实时荧光定量PCR检测NALSV标准曲线Figure 4 The standard curve of the NALSV real-time qPCR assay

2.4 NALSV实时荧光定量PCR检测方法的评价

2.4.1 特异性实验 实验结果显示（图5），仅有阳性对照出现扩增曲线，其他反应及阴性对照均无扩增，表明所建立的方法特异性良好。

图5 实时荧光定量PCR检测NALSV特异性实验Figure 5 Specific experiment for NALSV by Real-time qPCR

2.4.2 敏感性实验 实验结果显示（图6），NALSV 阳性标准品可检出的最低拷贝数为2.5×10 copies·μL，表明所建立的方法敏感性良好。

图6 实时荧光定量PCR检测NALSV敏感性实验Figure 6 Sensitivity test for NALSV by Real-time qPCR

2.4.3 重复性实验 重复性实验结果表明，NALSV变异系数低于0.5%，表明所建立的方法重复性良好（表1）。

表1 实时荧光定量PCR检测NALSV重复性实验
Table 1 Reproducibility experiment for detecting NALSV by Real-time qPCR

注：SD.标准差；
CV.变异系数。
Note：SD.standard deviation;CV.coefficients of variation

拷贝数/（copies·μL-1）Number of copies 1.0×108 1.0×107 1.0×106 1.0×105 1.0×104 CT 值CT value 12.471 15.737 19.322 22.598 26.214 12.491 15.906 19.188 22.812 26.319 12.395 15.816 19.387 22.654 26.125 CT平均值Mean CT 12.452 15.820 19.299 22.688 26.219标准差SD 0.041 0.069 0.083 0.091 0.079变异系数CV/（%）0.33 0.43 0.43 0.40 0.30

2.4.4 稳定性实验 实验结果显示（表2），5组不同拷贝数的质粒在不同时间段进行反应，其C值无显著变化，表明所建立的方法稳定性良好。

表2 冷冻保存的质粒于不同时间段进行实时荧光定量PCR反应所得C值
Table 2 C value of standard detected by Real -time PCR at different time

时间Time第1周First week第2周Second week第3周Third week第4周Fourth week CT值（CT value）1.0×108copies·μL-1 12.682±0.06 12.991±0.09 13.225±0.12 13.741±0.14 1.0×107copies·μL-1 15.992±0.08 16.384±0.09 16.714±0.11 17.386±0.14 1.0×106copies·μL-1 19.591±0.08 19.921±0.09 20.387±0.14 20.914±0.16 1.0×105copies·μL-1 22.942±0.07 23.316±0.10 23.681±0.09 24.498±0.13 1.0×104copies·μL-1 26.578±0.11 26.824±0.09 27.119±0.15 27.883±0.18

2.4.5 实时荧光定量PCR与普通PCR敏感性比较 对比实时荧光定量PCR 与普通PCR 的敏感性实验结果显示，普通PCR 对NALSV 阳性标准品可检出的最低拷贝数为1.0×10copies·μL，远高于实时荧光定量PCR 对NALSV阳性标准品可检出的最低拷贝数2.5×10copies·μL。

2.5 蜱样本检测

取2020 及2021 年采集于辽宁省及内蒙古自治区共计18 个地区环境中的540 头游离蜱，其中森林革蜱92头，长角血蜱281 头，草原革蜱167 头。用NALSV 的Real-time qPCR 方法进行样本检测。结果显示，阳性对照及234头蜱样本出现扩增曲线，其他蜱样本及阴性对照均为无扩增曲线，阳性率为43.3%，其中森林革蜱阳性率29.3%，长角血蜱阳性率63.7%，草原革蜱阳性率34.7%。检测结果表明所建立的方法可初步用于NALSV的检测。

蜱、蚊等节肢动物是黄病毒科成员的主要载体和传播媒介。近年来，随着全球气候变暖与生态环境的不断改变、城市化进程的加快、旅游和贸易的快速发展，导致包括蜱在内的病媒生物的分布有持续扩大的趋势。此外，动物的运输和候鸟等野生动物的迁徙可为蜱及其携带病原实现远距离传播提供了可能性。黄病毒科成员种类众多且不断有新的成员被发现，其中许多种病毒是重要的人兽共患病病原体，已经成为了全球性的公共卫生问题。它们主要通过蚊或蜱等媒介生物传播，可导致人的病毒性出血热，表现为昏迷、发烧、抽搐、呕吐、头疼、嗜睡、关节及肌肉疼痛、皮疹等症状，甚至导致死亡，对人类健康构成重大的威胁。部分黄病毒成员目前被认为是潜在的病原，尚未证实其可导致人体发病，但随着病毒基因组的不断进化、重组，其感染性和致病性可能随之发生改变，未来存在感染人和动物的风险。

ALSV 是一种新发现的蜱传黄病毒，由于其对人的严重危害而引起了世界范围内的广泛关注。但与SLSV亲缘关系较近的NALSV 为本实验室首次识别，其对人和动物的致病性、在自然界的分布与传播等工作尚未系统开展。这些工作有赖于灵敏、快速、准确的诊断技术的研发。实时荧光定量PCR 检测方法操作简便、快速高效、具有很高的敏感性和特异性，且封闭性好，不需要后续处理，造成核酸污染的可能性较低，显著的优越性使得该方法在生物技术方面应用广泛。

本实验选取NALSV病原的保守区域设计特异性引物和TaqMan探针，通过对反应条件及反应体系的优化，最终建立了基于TaqMan 探针的实时荧光定量PCR 检测方法。通过标准曲线的建立及大量实验结果的分析，表明所建立的方法特异性强、灵敏度高、线性关系良好、重复性良好、稳定性良好。为进一步验证所建立方法的临床适用性，对采集自辽宁省及内蒙古自治区环境中的540份蜱样本进行检测，发现NALSV 的阳性检出率为43.3%，表明本方法适用于样本的检测，同时说明该病毒在各地的蜱中均有广泛分布。东北地区东部的长白山区、西部的努鲁尔虎山区均是蜱传病的高风险区，每年都有大量的农民、牧民等人群被蜱攻击，且近年来蜱虫的分布范围有明显的扩大趋势，具备病毒传播、扩散的条件。虽尚无NALSV导致人感染发病的报道，但其作为潜在人兽共患传染病的风险随时存在，也可能作为伴发感染而导致其它蜱传病的病情复杂化，不利于精准诊断和治疗。因此，经常出入林区、在野外工作的人员以及相关疾控部门需引起足够重视。个人要加强自身防护，管理部门要具有忧患意识，未雨绸缪，建立起完善的病毒监测体系及流行病学资料库，做到早发现、早报告、早治疗。相关科研人员也应加大对NALSV的病原生态、感染机制等方面的研究，以期对该病毒有更深入的认识。

综上所述，本实验所建立的NALSV 实时荧光定量PCR 检测方法具有特异性强、灵敏度高、线性关系良好、重复性良好、稳定性良好等特点，为NALSV 的病原检测提供了新的技术方法，为NALSV 的分布监测、临床诊断及相关研究奠定了基础，具有重要的现实意义及应用价值。

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