李乐凯，吴业红，徐军，迟祥，李爽，席莉，张雪梅，郭占龙

长春生物制品研究所有限责任公司，吉林 长春 130012

流行性感冒病毒主要分为甲（A）、乙（B）、丙（C）3型，其中甲型流感病毒多次引起世界性大流行［1］。接种流感疫苗是预防流感最有效、最经济的手段。我国目前使用的流感疫苗均为鸡胚基质流感疫苗，生产工艺虽成熟，但仍存在不可忽视的问题：如疫苗产量完全受控于鸡胚的供应量，大流行期间无法满足需求；
疫苗生产过程繁琐，周期长；
鸡胚培养流感病毒会导致某些抗原性的改变；
卵清蛋白的残余会导致过敏等。因此，开发替代途径迫在眉睫。使用哺乳动物细胞作为流感病毒培养基质是一种可行的途径［2-3］。MDCK细胞对多种流感病毒敏感，可利用无血清培养基培养［4］，且已证实可用于流感疫苗生产，国外已有产品上市。MDCK细胞作为一种新的细胞基质，可稳定生产流感疫苗［5-6］。与鸡胚培养流感病毒相比，无血清全悬浮培养的MDCK细胞更易扩大生产规模，生产周期更短［7］；
培养过程中无需添加血清，避免了外源因子污染，降低了下游纯化难度；
由于使用哺乳动物细胞，培养的流感病毒免疫原性不会发生较大改变［8］；
安全性更高，质量可控，不会存在鸡胚流感疫苗过敏等问题。

本研究从pH、溶氧（DO）、搅拌速率及接种密度等方面对MDCK细胞无血清全悬浮培养条件进行优化，同时进行培养规模的放大验证，并对4种型别流感病毒进行培养，为细胞基质流感疫苗的研发奠定基础。

1.1 细胞及病毒MDCK细胞来自ATCC，经无血清悬浮驯化获得；
适应MDCK细胞的流感病毒流行株A／California／7／2009、A／Texas／20／2012、B／Brisbane／60／2008、B／Phuket／3073／2013和1%鸡红细胞悬液均由长春生物制品研究所有限责任公司提供。

1.2 主要试剂及仪器CD MDCK 244培养基（220-39244.1）购自甘肃建顺生物科技有限公司；
DMEM培养基（02-5062EJ）购自美国赛默飞世尔公司；
血清及标准抗原购自英国国家生物制品检定所（NIBSC）；
标准抗体由NIBSC提供；
8% NaHCO3溶液、0.01 mol／L PBS和1.5%胰蛋白酶由长春生物制品研究所有限责任公司制备；
5 L生物反应器购自荷兰Applikon Biotechnology公司；
10 L生物反应器购自美国NBS公司；
50 L生物反应器购自上海日泰医药设备工程有限公司；
细胞计数仪购自上海睿钰生物科技有限公司；
生化分析仪M900购自深圳西尔曼科技有限公司。

1.3 细胞复苏及传代 从液氮中取出1支冻存的MDCK细胞，置于37～40℃温水中迅速解冻；
加入10 mL新鲜培养基混匀后，800 r／min离心5 min，弃上清，加入10 mL新鲜培养基，重悬细胞，吸取至125 mL细胞摇瓶中，置37℃，120 r／min摇床上培养48 h。按1.5×106个 ／mL的接种密度传代，取复苏后15代以内的细胞进行后续试验。

1.4 MDCK细胞无血清全悬浮培养条件的优化

1.4.1 pH的优化 使用5 L生物反应器，在37℃、150 r／min、DO50%、接种密度为1.2×106个 ／mL的条件下，分别在pH 6.6、6.8、7.0、7.2条件下培养MDCK细胞。每24 h取样计数，每个条件培养3次。

1.4.2 DO的优化 使用5 L生物反应器，在37℃、150 r／min、pH 7.0、接种密度为1.2×106个 ／mL的条件下，分别在DO30%、DO50%、DO70%条件下培养MDCK细胞。每24 h取样计数，每个条件培养3次。

1.4.3 转速的优化 使用5 L生物反应器，在37℃、DO70%、pH 7.0、接种密度为1.2×106个 ／mL的条件下，分别在150及200 r／min的条件下培养MDCK细胞。每24 h取样计数，每个条件培养3次。

1.4.4 接种密度的优化 使用5 L生物反应器，在150 r／min、37℃、DO70%、pH 7.0的条件下，分别在接种密度为0.6×106、0.8×106、1.2×106、1.5×106个 ／mL的条件下培养MDCK细胞。每24 h取样计数，每个条件培养3次。

1.5 细胞培养规模放大及条件验证 采用优化后的培养条件，使用5 L生物反应器连续培养6次细胞，每24 h取样计数；
并采用相同培养条件，使用50 L生物反应器连续培养6次细胞，每24 h取样计数。

1.6 流感病毒培养

在50 L生物反应器中，使用病毒维持液（DMEM培养基）稀释细胞至密度为（1.8～2.2）×106个／mL，同时按MOI=10-4添加病毒及胰酶（终浓度为15 μg／mL），分别于33.5℃培养乙型流感病毒，34.5℃培养甲型流感病毒。每24 h取样计数，并检测各项生化指标、血凝效价、病毒滴度（CCID50）及血凝素（hemagglutinin，HA）含量。

1.6.1 血凝效价检测 于96孔U型血凝板各孔中加入25 μL PBS缓冲液，第1孔加入25 μL病毒悬液，充分混匀，取25 μL加入第2孔，以此类推，至最后1孔，混匀后，弃去25 μL，同时设PBS作为阴性对照。每孔中加入25 μL 1%鸡红细胞悬液，混匀，置室温25～30 min，观察结果［9］。

1.6.2 病毒滴度检测 按照2.0×104个 ／孔将MDCK细胞接种至96孔板中，37℃培养过夜；
待细胞长满单层后，用PBS洗涤2次，加入病毒稀释（1∶9稀释），100 μL／孔，分别于33.5℃（乙型）和34.5℃（甲型）吸附1.5 h；
弃去吸附液，每孔加入200 μL新鲜DMEM，置33.5℃（乙型）／34.5℃（甲型），5%CO2生化培养箱培养72 h，根据Reed-Muench法计算CCID50。

1.6.3 HA含量检测 取洗净烘干的玻璃板放在水平桌面上。按每板15 mL的量配置1.5%琼脂糖凝胶。按WHO提供的参考品说明书取标准抗体加入15 mL琼脂糖凝胶中，混匀后浇于玻璃板上，凝固后用打孔器打孔，孔与孔之间间距均匀（7～10 mm），孔径为4 mm。

根据待测样品型别选取相应型别标准抗原，按WHO提供的参考品说明书用纯化水稀释至40 μg／mL，取180 μL标准抗原和20 μL去污剂加入离心管中，混匀后置室温裂解30 min。用PBS将裂解好的标准品按照3∶4（30 μg／mL）、1∶2（20 μg／mL）、1∶4（10 μg／mL）的梯度在相应离心管中进行稀释。将待测样品按照相同方式处理后，分别将处理好的抗原及样品加入含抗体的琼脂糖凝胶板孔中，每孔20 μL，平行做2孔，置20～25℃孵育18～19 h后，进行染色及脱色处理。绘制标准曲线，计算HA含量。

1.7 统计学分析 使用PASWStatistics 18软件进行方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 MDCK细胞无血清全悬浮培养条件的优化

2.1.1 最佳pH pH=6.6时，活细胞密度虽呈上升趋势，但培养72 h后仅能达到（2.85±0.10）×106个 ／mL；
pH=6.8时，活细胞密度达（10.1±0.11）×106个 ／mL；
pH=7.0时，活细胞密度达（10.44±0.68）×106个 ／mL；
pH=7.2时，培养效果略优于pH=6.6，但仍仅能达到（3.12±0.17）×106个／mL。各pH条件下细胞活率均在97%以上。pH=6.6、6.8、7.0时，细胞直径在14～16 μm之间，细胞形态正常；
pH=7.2时，细胞直径超过16 μm，细胞形态不正常。各pH条件下活细胞密度差异有统计学意义（F=416.984，df=3，8，P=4.002×10－9）。pH=7.0时细胞密度略高于pH=6.8，因此，选择pH=7.0作为MDCK细胞培养时最佳pH。见图1。

图1 不同pH条件下MDCK细胞的细胞密度（A）、活率（B）、平均直径（C）Fig.1 Cell density（A），viability rate（B）and average diameter（C）of MDCK cells at various pH values

2.1.2 最佳DO DO30%时，MDCK细胞基本不生长，培养72 h后活细胞密度仅为（2.05±0.09）×106个 ／mL；
DO50%时，培养72 h后活细胞密度达（10.44±0.68）×106个 ／mL；
而当DO70%时，培养72 h后活细胞密度达（11.1±0.33）×106个 ／mL。各DO条件下细胞活率均在96%以上。DO50%、70%时，细胞直径在14～16 μm之间，细胞形态正常；
DO30%时，细胞直径超过16 μm，细胞形态不正常。各DO条件下活细胞密度差异有统计学意义（F=395.537，df=2，6，P=4.265×10-7）。因此，选择DO70%作为MDCK细胞培养时最佳DO。见图2。

图2 不同DO条件下MDCK细胞的细胞密度（A）、活率（B）、平均直径（C）Fig.2 Cell density（A），viability rate（B）and average diameter（C）of MDCK cells at various DO concentrations

2.1.3 最佳转速 转速为150 r／min时，培养72 h后活细胞密度达（10.44±0.68）×106个 ／mL；
转速为200 r／min时，培养72 h后活细胞密度达（9.3±0.03）×106个 ／mL。各转速条件下细胞活率均在97%以上，且细胞直径均在14～16 μm之间，细胞形态正常。各转速条件下活细胞密度差异有统计学意义（F=8.465，df=1，4，P=0.044）。因此，选择150 r／min作为MDCK细胞培养时最佳转速。见图3。

图3 不同转速条件下MDCK细胞的细胞密度（A）、活率（B）、平均直径（C）Fig.3 Cell density（A），viability rate（B）and average diameter（C）of MDCK cells at various rotation rates

2.1.4 最佳接种密度 接种密度为0.6×106个／mL时，培养72 h后活细胞密度达（6.14±0.24）×106个／mL，培养96 h后活细胞密度才能达到（9.8±0.03）×106个 ／mL；
接种密度为0.8×106个 ／mL时，培养72 h后活细胞密度达（9.99±0.11）×106个 ／mL；
接种密度为1.2×106个 ／mL时，培养72 h后活细胞密度达（10.44±0.68）×106个 ／mL；
接种密度为1.5×106个 ／mL时，培养72 h后活细胞密度达（10.5±0.13）×106个／mL。各接种密度条件下细胞活率均达96%以上，细胞直径在14～16 μm之间，细胞形态正常。各接种密度条件下活细胞密度差异有统计学意义（F=96.774，df=3，8，P=1.259×10-）6。考虑到减少摇瓶细胞用量以及过多操作等因素，选择接种密度为（0.8～1.2）×106个／mL作为MDCK细胞培养时最佳接种密度。见图4。

图4 不同接种密度条件下MDCK细胞的密度（A）、活率（B）、平均直径（C）Fig.4 Cell density（A），viability rate（B）and average diameter（C）of MDCK cells at various inoculation densities

2.2 细胞培养规模放大及条件验证 连续6批次的培养过程中，5 L、10 L、50 L生物反应器培养的活细胞密度均达8.0×106个／mL以上，见图5。

图5 细胞培养规模放大及培养条件验证（培养72 h后的活细胞密度）Fig.5 Scale-up of cell culture and verification of culture conditions（viable cell density after culture for 72 h）

2.3 流感病毒培养效果

2.3.1 细胞状态 活细胞密度在感染后24～48 h表现出明显上升趋势，仅感染BY的细胞密度表现为先上升后下降。感染甲型流感病毒的细胞活率持续下降，感染乙型流感病毒的细胞活率在感染后24～48 h表现出明显上升趋势。细胞在感染后的24 h直径变大，之后逐渐变小，平均直径变小。见图6。

图6 不同型别流感病毒培养过程中细胞密度（A）、活率（B）、平均直径（C）的变化Fig.6 Changes in cell density（A），viability rate（B）and average diameter（C）during culture of various types of influenza virus

续图6 不同型别流感病毒培养过程中细胞密度（A）、活率（B）、平均直径（C）的变化Fig.6（Continued）Changes in cell density（A），viability rate（B）and average diameter（C）during culture of various types of influenza virus

2.3.2 生化指标 细胞在产毒期消耗葡萄糖、谷氨酰胺，用于细胞状态的维持以及流感病毒的合成；
同时生成乳酸、谷氨酸。见图7。

图7 不同型别流感病毒培养过程中细胞葡萄糖（A）、谷氨酰胺（B）、乳酸（C）、谷氨酸（D）含量的变化Fig.7 Changes in contents of glucose（A），glutamine（B），lactate（C）and glutamate（D）during culture of various types of influenza virus

续图7 不同型别流感病毒培养过程中细胞葡萄糖（A）、谷氨酰胺（B）、乳酸（C）、谷氨酸（D）含量的变化Fig.7（Continued）Changes in contents of glucose（A），glutamine（B），lactate（C）and glutamate（D）during culture of various types of influenza virus

2.3.3 血凝效价4种型别流感病毒的血凝效价均能达到7 log（2HAU／25 μL）以上，其中H3N2效价最高，可达11 log（2HAU／25 μL）；
BV、BY可达9 log2（HAU／25 μL）。见图8。

图8 不同型别流感病毒72 h收获液的血凝效价Fig.8 Hemagglutination titers of various types of influenza virus harvested 72 h after culture

2.3.4 病毒滴度4种型别流感病毒的CCID50均能达到6.5以上，见图9。

图9 不同型别流感病毒72 h收获液的病毒滴度Fig.9 CCID50 of various types of influenza virus harvested 72 h after culture

2.3.5 HA含量 除H1N1外，其余3种型别流感病毒培养HA含量均能达35 μg／mL以上，H1N1仅能达20 μg／mL，见图10。

图10 不同型别流感病毒72 h收获液的HA含量Fig.10 HA contents of various types of influenza virus harvested 72 h after culture

与贴壁培养方式相比，悬浮培养的MDCK细胞在培养过程中不需添加血清，减少了外源因子污染；
无需使用胰酶消化，简化了操作步骤；
大规模培养不使用微载体，降低了成本，提高了设备利用率，易于培养规模放大；
减小了下游纯化难度。因此，使用全悬浮无血清培养的MDCK细胞生产流感疫苗，是替代鸡胚生产流感疫苗的可行途径。本研究确定了在5 L、10 L及50 L生物反应器中悬浮MDCK细胞的培养工艺：接种密度（0.8～1.2）×106个 ／mL，转速150 r／min；
DO70%，pH 7.0。

本研究采用的流感病毒培养方式为使用病毒维持液直接稀释细胞，同时添加病毒及胰酶。在病毒培养过程中，H1N1的血凝滴度可达7 log（2HAU／25 μL），HA含量仅能达到20 μg／mL；
H3N2的血凝滴度可达11 log（2HAU／25 μL），HA含量达40 μg／mL；
BV的血凝滴度可达9 log（2HAU／25 μL），HA含量达30 μg／mL；
BY的血凝滴度可达9 log（2HAU／25 μL），HA含量达40 μg／mL。以此生产工艺为基础，4种型别的流感病毒培养效果达到预期，但仍存在可优化的空间。感染时，培养条件的影响可能会降低或提高流感病毒的培养效果，如胰酶终浓度、MOI等［10-12］。除去培养条件等因素，细胞表面受体及病毒维持液的成分可能也会影响流感病毒的培养效果，适当提高氨基酸的含量或添加丁酸钠（NaBu）会提高流感病毒产量［13］。

综上所述，经培养条件的优化，本研究初步建立了生物反应器高密度悬浮MDCK细胞的无血清细胞和病毒培养工艺，为下一步研制细胞基质流感疫苗奠定了实验基础。

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