张奕雯，骆杨平

高脂血症是指血浆中甘油三酯（TG）和（或）胆固醇（TC）升高，也包括低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）升高和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）降低，可导致动脉粥样硬化（AS）、冠心病（CHD）、胰腺炎等。据统计分析，目前我国成人高脂血症的患病率高达40.40%[1]，预测从2010～2030年，每年的心血管事件将增加50%[2]，因此有效控制血脂水平，对防控心脑血管疾病、降低心血管事件发生尤为重要。目前广泛应用的他汀类等调脂药物，调脂效果较好，但是作用机制单一、副作用多，在应用过程中仍受限，因此开发更加有效、更加安全的降脂药物是不可或缺的。

高脂血症在中医学属于“眩晕”“胁痛”范畴，亦有“脂浊”之说，治疗原则为消痰化瘀、健脾和胃。脂必泰胶囊是由红曲、泽泻、白术、山楂四味中药组方[3]，其中红曲有消痰化瘀功效，泽泻、白术、山楂有健脾和胃功效，该组方正中高脂血症的病机，为治疗高脂血症提供新思路。

脂必泰胶囊的成分较为复杂、作用靶点不确定，常规的药理学研究方法难以全面阐明其治疗高脂血症的机制，本文主要借助网络药理学对脂必泰胶囊治疗高脂血症的主要活性成分、作用靶点、作用通路等方面进行探讨，进一步明确脂必泰胶囊治疗高脂血症的机制。

1.1 脂必泰活性成分、靶点筛选使用传统药物数据库TCMSP、Herb、SymMap、TCMID和TCM-ID数据库收集脂必泰的活性成分，依次在各数据库中输入“山楂”、“泽泻”、“白术”、“红曲”四味中药收集汇总成分，在TCMSP中选择药物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，类药性（drug-likeness，DL）≥0.18%作为筛选条件，并在TCMSP筛选相应成分的预测靶点。

1.2 高脂血症基因靶点收集通过对CTD、TTD、DisGeNET、OMIM、Genecards和DigSee等多种疾病数据库进行检索，检索关键词为“hyperlipemia”，尽可能收集更为全面的高脂血症靶点资料，去除重复的靶点作为高脂血症靶点资料。

1.3 脂必泰-高脂血症共同靶点网络构建与分析借助韦恩图工具（Draw wenn diagram）将脂必泰作用靶点映射到高脂血症靶点，获取脂必泰-高脂血症共同靶点基因。运用Cytoscape 3.7.2软件构建活性成份-疾病-靶点相互作用的网络图，并进行拓扑学分析。

1.4 共同靶点蛋白-蛋白（PPI）互作分析运用STRING数据分析共同靶点的蛋白-蛋白互作分析，物种选择“Homo sapiens”，最低相互作用阈值为0.400，其余参数保持默认设置不变，结果保存为TSV文本输出，并将其导入Cytoscape 3.7.2软件进一步分析，运用“cytoHubba”插件获得关键靶蛋白。

1.5 基因本体论（GO）生物过程分析以及京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析使用R的clusterProfiler软件包（R 4.0.2 for Windows）进行GO富集分析和KEGG通路富集分析，其中GO分析包括生物学过程（BP）、细胞学组分（CC）、生物学功能（MF），设置p value Cut-off=0.05，q value Cut-off=0.2为具有意义的富集结果。

1.6 成分-靶蛋白分子对接在PDB数据库和ZINC数据库中下载相应的蛋白的PDB文件和化合物成分的mol2格式文件，运用AutoDock软件完成分子对接，对接使用Lamarckian genetic algorithm（LGA）算法。计算结合能（BE）（kJ mol-1）来评估脂必泰活性成分与高脂血症靶蛋白的结合活性，一般小于-5.0 kal/mol的对接结合能被认为具有良好的结合相互作用，最后运用PyMOL软件进行可视化。

2.1 脂必泰活性成分、靶点筛选在设置“OB≥30，DL≥0.18”的条件下共获得山楂9种，泽泻9种，白术15种，红曲暂未收集具备条件的成分，去除重复及无靶点的成分后共获得23种有效活性成分，210个靶点，具体活性成分见表1，由表可知，生物口服利用度最高的是百部碱（stemonine），类药性最高的是泽泻醇C醋酸酯（alisol C monoacetate）。

表1 脂必泰活性成分列表

2.2 脂必泰-高脂血症共同靶点网络构建与分析

2.2.1 高脂血症基因靶点收集对CTD、TTD、DisGeNET等疾病数据库检索，去除重复靶点后共获得1833个高脂血症相关度较高的靶点基因，通过韦恩图工具将脂必泰潜在作用靶点映射到获得的高脂血症相关靶点中，共获得129个共同靶点（图1）。

图1 脂必泰与高脂血症靶点韦恩图

2.2.2 共同靶点网络构建与分析运用Cytoscape 3.7.2构建“成分-靶点”网络图（图2），该网络图中包含共 154个节点和302条作用线。通过网络分析得出，活性成分中度值最高的是槲皮素，其次是山奈酚、异鼠李素、芒柄花素。

图2 成分-靶点网络图

2.3 共同靶点PPI互作分析运用Cytoscape 3.7.2软件中分析蛋白-蛋白互作网络的TSV文件，该网络中包含128个节点，2443条边，结果见图3，节点代表Degree值的大小，Degree值越大，说明这个节点作用越大。运用“cytoHubba”插件进一步分析，根据发现TOP10的核心靶点为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）、白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF）、血管内皮生长因子（VEGFA）、肿瘤蛋白P53（TP53）、半胱天冬蛋白酶3（CASP3）、前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、AP-1转录因子（JUN）、丝裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）。

图3 PPI互作网络图

2.4 GO和KEGG富集分析应用R中的clusterProfiler分析GO富集和KEGG通路富集，相关基因靶点主要富集了2322条生物学过程，43条细胞组成分，161条生物学功能，根据P值的8-*显著性取各前10的条目见图4。显而易见，BP涉及对脂多糖反应（response to lipopolysaccharide）、对细菌源分子反应（response to molecule of bacterial origin）、活性氧代谢过程（reactive oxygen species metabolic process）、营养水平（response to nutrient levels）、氧气水平反应（response to oxygen levels）等，CC涉及膜筏（ membrane raft）、膜微结构域（membrane microdomain）、质膜筏（plasma membrane raft）、RNA聚合酶Ⅱ转录因子复合物（RNA polymerase Ⅱ transcription factor complex）等，MF涵盖核受体活性（nuclear receptor activity）、转录因子活性（transcription factor activity），直接配体调控序列特异性DNA结合（direct ligand regulated sequencespecific DNA binding）、类固醇激素受体活性（steroid hormone receptor activity）、细胞因子活性（cytokine activity）、丝氨酸水解酶活性（serine hydrolase activity）等。

图4 GO富集分析气泡图

KEGG通路富集分析获得了168条通路，图5展示了前20条显著性较高的通路，由图可知，脂必泰治疗高脂血症涉及的通路有脂质与动脉粥样硬化通路（Lipid and atherosclerosis）、糖尿病并发症中AGE-RAGE信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、流体剪切应力与动脉粥样硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）、IL-17信号通路（IL-17 signaling pathway）、TNF信号通路（TNF signaling pathway）、HIF-1信号通路（HIF-1 signaling pathway）等。

图5 KEGG通路富集条形图

2.5 成分-靶蛋白分子对接选择PPI结果的10个核心靶点与之对应成分数较多的7种关键成分进行分子对接，运行AutoDock软件共进行70次。对接结果分析，所有对接结合能均小于-5.0 kal/mol，部分结果见表2，由表可知，豆甾醇与AKT1结合度最高，β-谷甾醇与多种关键靶点结合度高。取结合能较高的8对结果在Pymol软件中进行可视化。由图6可知，豆甾醇与AKT1有氢键相连，并于ARG-273、TYR-272残基相互作用，β-谷甾醇与PTGS2、TNF、TP53等具有氢键连接，与AKT1的HIS-180有π键-烷基相互作用。所有成分与核心蛋白的残基均有氢键连接，进一步说明分子与蛋白之间结合紧密，进而表明，脂必泰的治疗作用可能是通过调节这些核心靶点来实现。

图6 脂必泰有效成分与靶点蛋白分子对接

表2 脂必泰有效成分与靶点蛋白分子对接结合能

作为心血管疾病的一项主要危险因素，高脂血症与遗传易感性、饮食摄入、机体代谢、胰岛素抵抗、氧化应激、促炎性脂肪因子等因素密切相关。血脂和脂蛋白的水平、氧化应激、炎症、内皮细胞损伤等因素是高脂血症影响AS进程中的关键环节。脂必泰胶囊目前广泛应用于临床治疗，且与他汀类等西药相比，被证明综合调脂作用强、不良反应少、安全高[4]，由于脂必泰胶囊是由四种中药组成，而中药的成分复杂、靶点众多等原因，其作用机制一直是研究的重难点，目前脂必泰胶囊是如何调节血脂水平仍尚未阐明，本文通过网络药理学方法对可能的作用靶点及机制一一阐述。

本研究得出脂必泰胶囊的活性成分有槲皮素、山奈酚、异鼠李素、芒柄花素等，其调节血脂的核心靶点包括AKT1、IL-6、TNF、VEGFA、TP53、CASP3、PTGS2、MAPK1、JUN、MAPK8等，涉及炎症因子、转录因子、脂质代谢相关因子等方面。目前已有相关研究[5-7]发现与脂质代谢相关靶点有AKT1、TP53、TNF、IL-6等，与本研究结果相同。其中AKT参与多种生物学过程，包括代谢、胰岛素信号传导、血管生成等信号，通过刺激碳水化合物反应性元素结合蛋白（ChREBP）的活性来调节葡萄糖转运和胰岛素敏感性，及脂肪细胞的合成[8]，一项实验研究表明盐诱导激酶2（SIK2）可通过PI3K/AKT信号通路促进胆固醇调节元件结合蛋白1c（SREBP1c）和SREBP2的上调，促进脂肪酸和胆固醇的合成[9]，推断脂必泰胶囊可能是抑制PI3K/AKT通路，从而降低脂质水平。IL-6、TNF是两种细胞因子，它们生物学功能丰富，主要参与免疫应答、炎症反应等，已成为衡量高脂血症的指标。炎症反应可刺激脂肪细胞的氧化应激反应，影响其增殖分化、细胞因子分泌及对胰岛素敏感性等生物学过程，进而导致血脂异常和脂肪蓄积[10]。相关研究表明，槲皮素、山奈酚可通过抑制TNF和IL-6的水平、核因子κB（NF-κB）的活化，阻断主动脉组织和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中的NFκB/AP-1信号通路、Nrf2/HO-1信号通路，保护血管调节氧化应激、炎症和细胞凋亡[11,12]。CASP3作为一种凋亡蛋白酶在AS斑块中表达，与细胞凋亡和动脉粥样硬化相关。高脂血症可促进脂质过氧化形成ox-LDL，在CASP3介导下升高NF-κB水平，加速内皮细胞的损伤，加重AS程度[13]。其中山奈酚可通过下调TP53，激活CASP3/9和聚ADP核糖聚合酶（PARP）的水平来减弱细胞凋亡[12]。以上研究说明，脂必泰胶囊可能通过上述核心成分共同作用于相关靶点来调节脂质的合成和代谢，从而发挥降脂、抗氧化、抗炎等丰富的作用，同时脂必泰胶囊的其他活性成分也可能通过其他靶点起到调脂作用。

在KEGG通路富集分析中，其中脂质与动脉粥样硬化通路是显著性最高的，主要是由于血管中LDL进入血管内皮细胞氧化修饰成ox-LDL，巨噬细胞吞噬受损内皮上的ox-LDL，并转变为泡沫细胞，诱发炎症反应并合成和分泌更多的生长因子及促炎介质，进而促进斑块生长及加重炎症反应[14]。Jia等[15]研究表明槲皮素通过调节PCSK9、CD36、PPAR+、LXR+和ABCA1的表达，从而防止AS在apoE-/-小鼠中的发展。在AGE-RAGE信号通路中，晚期糖基化终末产物（AGE）在氧化应激、炎症反应、AS中发挥重要作用，AGE与其受体RAGE参与并介导的NADPH氧化酶等多种信号通路促使NOS生成，激活NF-κB，并分泌大量炎性因子，最终会加快AS的进展[16]。血脂异常加重炎症反应，导致血管内皮损伤，同时血管内皮细胞损伤又使抗炎因子和促炎因子失衡，包括TNF信号通路、IL-17通路等被激活，进一步加重血管内皮的损伤，促进AS斑块的形成[17]。HIF-1是作为缺氧传感器，缺氧环境下HIF-1通过转录因子PPARγ和增加脂肪酸结合蛋白（FABPs 3、4、7）的表达，促进细胞外脂肪酸（FA）摄取，上调低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1）和极低密度脂蛋白受体（VLDLR）促进脂蛋白的内吞作用，最终导致缺氧条件下的脂质积累[18]。以上分析可以推测出脂必泰胶囊可以通过脂质与动脉粥样硬化通路、AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路，达到抗AS、调节内分泌代谢、介导炎症反应来调节血脂水平。

综上所述，本文基于网络药理学揭示了多成分、多靶点、多通路之间的紧密相互作用，并增加了对于脂必泰胶囊治疗高脂血症的作用机制了解。但是网络药理学是根据网络数据库分析的，可能受到数据库的完整性影响，同时也未能考虑药物活性成分在人体中药代动力学中的改变，在该分析的基础上仍需完善体内外实验进一步验证结果。

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