蒋 锋，梁日朗，闫 艳，梁泽恩，黄正刚，刘鹏飞

（1.仲恺农业工程学院农业与生物学院，广东 广州 510225；
2.广州市特色作物种质资源研究与利用重点实验室，广东 广州 510225）

【研究意义】甜玉米是普通玉米籽粒在淀粉合成代谢途径中1 个或几个基因发生突变，造成淀粉合成受阻，蔗糖等糖类物质积累而形成的特用玉米类型［1］。甜玉米营养丰富、适口性好、经济效益高，深受广大消费者喜爱。甜玉米果皮由不可消化的纤维素、多糖等组成，果皮厚度是影响甜玉米口感的重要因素，也是评价甜玉米品质的重要指标［2］。研究果皮厚度性状的遗传规律，准确定位甜玉米果皮厚度的QTL，对挖掘利用果皮薄的甜玉米种质资源具有重要意义。【前人研究进展】研究表明，甜玉米的果皮厚度与采收期相关［3］。乐素菊等［4］研究玉米果皮的结构，表明果皮较薄的玉米材料果皮细胞层数较少，果皮细胞壁木质化程度较低。赵婕等［5］以玉米果皮的穿刺强度作为果皮柔嫩度的评价标准，发现果皮穿刺强度与果皮细胞层数以及果皮纤维素含量呈正相关，玉米果皮细胞的构造会影响果皮厚度。果皮厚度与遗传背景十分相关，并且具有较高的遗传力［6］。王晓明等［7］研究指出，加性-显性模型适用于超甜玉米的果皮厚度遗传，至少有3 对以上的基因控制果皮厚度，狭义遗传力29.6%。常大军等［8］指出，玉米的果皮厚度符合加性遗传模型。Wang 等［9］应用PFLP 标记技术，利用重组自交系（RIL）群体进行果皮厚度分析，在玉米的第1、2、6 号染色体上检测出与之相关的QTL。胡冲［［10］同样以糯玉米RIL 群体作为试验材料，定位到5 个与果皮厚度以及粒长有关的QTL，分别分布在第1、4、7、8、9 染色体上，其中4 个是主效QTLs，能在不同环境条件中稳定表达。于永涛等［11］以两个果皮厚度差异显著的材料的190 个BC2F2家系为作图群体，分别采用基于复合区间作图（CIM）和基于混合线性CIM模型（MCIM）两种遗传模型检测QTL，分别定位到3 个和5 个QTL 与果皮厚度相关。Choe 等［12］对韩国糯玉米种质果皮厚度进行QTL 检测，共定位到7 个QTL，检测到的QTL 之间不存在上位性互作效应。Park 等［13］在糯玉米第4、5、8、9 染色体上定位到与果皮厚度性状相关的QTL。【本研究切入点】针对甜玉米果皮厚度的遗传规律及QTL 挖掘研究仍不充分，本试验以甜玉米自交系T77 和T15 作为亲本配制杂交组合，利用主基因+多基因混合遗传模型分析方法对甜玉米果皮厚度进行遗传模型分析，利用SSR 分子标记构建遗传连锁图谱，结合F2群体的果皮厚度，应用复合区间作图法对甜玉米果皮厚度进行QTL 定位。【拟解决关键问题】对甜玉米果皮厚度进行遗传分析及相关QTL 定位，确定其遗传规律，找到与之紧密连锁的分子标记，以期为分子辅助选择果皮薄的甜玉米、创新甜玉米种质资源、选育优质新品种提供理论依据。

1.1 试验材料

试验亲本材料为果皮厚度有显著差异的2 个甜玉米自交系T77 和T15，分别是以泰国甜玉米品种先甜5 号和中国台湾甜玉米品种华珍为基础材料，经8 代自交、鉴定选育而成的sh2 型甜玉米，T77 果皮厚度为64.17（±0.35）μm，T15 果皮厚度为81.96（±0.37）μm。

主要试剂：Ezup 柱式植物基因组DNA 抽提试剂盒及其他生化试剂均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

主要仪器：GENETEST 系列基因扩增仪（杭州柏恒科技有限公司）、高速离心机（Thermo Fisher SCIENTIFIC，德国）、Nano-300 微量分光光度计（杭州奥盛仪器有限公司）、电泳仪（DYY-6C 型，北京市六一仪器厂）、GelDoc XR+全自动凝胶成像系统（BIO-RAD,美国）。

1.2 试验方法

亲本材料（自交系T77 和T15）在广州市番禺区仲恺农业工程学院科研教学基地进行田间种植与组合配制，双行垄作，行距60 cm，株距30 cm，行长约5 m，四周设立保护行防止串粉。2019 年3—6 月，利用T77（♀）和T15（♂）配制杂交组合得到F1代杂交种子，9—12 月F1种植并自交，收获得到F2种子；
2020 年3—6 月，分别种植2 个亲本各20 株，以及来自同一果穗上的216 个F2单株，从F2中选出200 株发育良好的果穗并套袋自交，于苗期对群体单株叶片采样，提取基因组总DNA 进行基因型分析，于采收期测量各单株果皮厚度表型。

1.3 测定项目及方法

1.3.1果皮厚度测定 将采收的鲜果穗，使用镊子取中间的10 粒籽粒用于测量。利用镊子与刀片分离籽粒顶部果皮，参照刘鹏飞等［14］的方法测量果皮厚度，每粒籽粒重复测量3 次，取其平均值作为甜玉米果皮厚度的最后观测值。

1.3.2DNA 提取和基因型分析 利用Paterson等［15］的方法提取F2群体玉米叶片DNA。参照Wang 等［9］的方法，从中选取800 对多态性高的SSR 引物，结合前人研究的玉米连锁遗传图谱［16-18］，再结合玉米基因组数据库（http://www.maizegdb.org）筛选出174 对在亲本T15 和T77 之间有多态性的引物，参照张姿丽等［19］方法PCR扩增以及聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定F2中每个单株的基因型。

使用Microsoft Excel 2010 对F2群体果皮厚度数据进行整理，利用数据调用函数列出数据频率分布表，参照盖钧镒［20］、王建康等［21］和章元明等［22］的方法计算各遗传模型的最大似然函数值以及AIC 值，选出备选模型，比较各备选模型的5 个适应性参数（U12、U22、U32、nW2、Dn）值，进一步确定最佳模型。利用最小二乘法估算一阶遗传参数和二阶遗传参数。

1.3.3数据处理及QTL 检测 借助JoinMap3.0 软件分析各个标记之间是否存在连锁关系，构建分子遗传图谱［23］。利用Windows QTL Cartographer 2.5软件程序结合复合区间作图法，在F2群体中检测果皮厚度的QTL［24］。在通过1 000 次LOD 值随机抽样确定其阈值（LOD＞2.5）。结合以上两个软件及F2群体果皮厚度表型数据，在构建的连锁图区域扫描与果皮厚度相关的QTL 位点，计算并得到LOD 值、加性效应值以及每个QTL 的表型贡献率。

QTL 命名方法参照McCouch 等［25］的命名规则，并按照一定的规律格式命名，即QTL+性状+染色体+QTL 个数，其中小写“q”作为QTL 的开始，英文缩写代表测定的性状，即PT（Pericarp Thickness）代表果皮厚度；
用“1、2、3”区别不同染色体上QTL 位点的顺序命名。

2.1 甜玉米F2 群体果皮厚度频数分布及正态分布

200 个甜玉米F2的果皮厚度平均值73.91 μm，变幅为61.23～84.76 μm，标准差4.84 μm，变异系数为6.54%，峰度、偏度分别为-0.41 和-0.16。根据变幅和变异系数可知，测定的甜玉米果皮厚度性状差异不显著，峰度及偏度的绝对值较小，未显著偏离正态分布，可进一步进行遗传分析和QTL 定位，并对F2的果皮厚度进行正态分布检验（图1）。

图1 A-1 模型 T77×T15 组合F2 果皮厚度的频数分布Fig.1 Distribution of pericarp thickness in F2 population of cross combination T77×T15 under A-1 genetic model

2.2 果皮厚度的遗传模型分析

利用F2果皮厚度的数据频率分布表，使用植物数量性状主基因+多基因混合遗传模型求出11个模型的极大似然值，利用极大似然值函数求出相应的AIC 值（表1）。当模型的AIC 值最小时，说明该模型观测值的估计概率分布与真实分布的拟合程度最高，即为备选的遗传模型；
当多个模型的AIC 值比较接近时，则可以有几个备选模型。由表1 可知，模型A-1 的AIC 值最小，同时A-0、B-3 和B-6 的AIC 值与A-1 十分接近，因此A-1、A-0、B-3、B-6 可作为备选模型。

表1 杂交组合T15×T77的F2 的11种备选遗传模型的极大似然函数值和AIC值Table 1 Max-likelihood-value (MLV) and AIC values of eleven candidategeneticmodels for F2 ofcrossco mbinationT15×T77

2.3 备选遗传模型的适合性检验

由表2 可知，4 个备选模型A-1、A-0、B-3、B-6 的U12、U22、U32（均匀性检验）均大于0.05，表示为不显著；
Dn（Kolmogorov 检验）值也未达到显著水平；
nW2（Smirnov 检验）表明4 个备选模型均不显著。由于A-1 模型AIC 值最小，因此可以得出甜玉米果皮厚度的最优模型是A-1，即表现为1 对加性-显性主基因遗传。

表2 果皮厚度备选遗传模型的适合性检验Table 2 Test for suitability of candidate genetic models for pericarp thickness

对遗传模型A-1 下成分（基因型）分布均值M、标准差SD 以及分布权重W 进行分析，由表3 的分布权重可知，F2的3 种成分分布比例为1 ∶2 ∶1，与理论分布比例一致。

表3 最适模型A-1 下F2 成分的分布均值、分布标准差和分布权重Table 3 Mean (M),standard deviation (SD) and weight of distribution (W) of F2 components under the optimal model A-1

2.4 甜玉米果皮厚度遗传模型的遗传参数估计

根据已确定的果皮厚度最优模型和IECM 估算方法［1］，对F2群体的果皮厚度性状进行遗传参数估计。总体均值m为73.55，主基因的加性效应d为-5.67，显性效应h为0.67，表型方差σ2P为23.40，遗传方差σ2mg为16.17，遗传率h2mg为69.10%，主基因遗传率较高。

2.5 甜玉米果皮厚度的标记连锁图谱构建

从800 对SSR 引物中筛选出174 对在亲本T15 和T77 之间有多态性的引物，在此基础上进行χ2测验，最后选出169 对符合1 ∶2 ∶1 分离比的引物。利用Joinmap3.0 软件分析处理试验数据，对多态性位点进行遗传连锁关系分析，得到SSR 标记遗传连锁图谱，其中包括151 个位点分布于玉米10 条染色体上，图谱总长度为1 270 cM（图2）。

图2 甜玉米T15×T77 组合F2 群体SSR 标记连锁遗传图谱分布Fig.2 Distribution of SSR linkage genetic map for sweet corn pericarp thickness in F2 population of cross combination T15×T77

2.6 甜玉米果皮厚度QTL 定位

由表4 可知，检测到3 个甜玉米果皮厚度相关基因的QTL，其中qPT-ch.5-1和qPT-ch.5-2位于第5 染色体上，qPT-ch.8-1位于第8 染色体上。qPT-ch.5-1的加性效应值为-2.39，显性效应值为0.17，位于bin5.04 区域，可以解释12.07%的表型变异，标记区间是bnlg150～bnlg653；
qPT-ch.5-2的加性效应值为-3.01，显性效应值为0.27，同样位于bin5.04 区域，标记落在bnlg653～bnlg1208 之间，表型贡献率14.68%；
第8 染色体上检测到的果皮厚度QTL（qPT-ch.8-1），其加性效应值为-3.06，显性效应值为-0.42，位于bin8.03～bin8.04 区域，标记区间umc1741～bnlg2046，表型贡献率22.02%。

表4 复合区间作图法检测到的果皮厚度QTLTable 4 QTL of pericarp thickness detected by compound interval mapping method

目前，植物数量性状遗传的“主基因+多基因遗传模型”方法已在多种作物中得到应用，如小麦［26-28］、水稻［29-30］、花生［31-33］等。这一方法能检测主基因及其遗传率，对于育种工作具有重要的指导作用。本研究对甜玉米果皮厚度进行主基因+多基因混合遗传模型分析，结果表明甜玉米果皮厚度遗传特点符合“加性-显性”遗传模型，与前人的研究结果［7-8,14］相似。本研究甜玉米果皮厚度的遗传效应不存在上位性互作，与于永涛等［11］研究结果不同，这可能与不同的试验材料、种植方式和测量方法有关。本研究的试验对象为甜玉米F2群体，下一步需结合多世代、不同组合进行验证，分析不同遗传背景下甜玉米果皮厚度的遗传模型。

研究者曾以果皮重量作为果皮厚度的指标，对泰国甜玉米重组自交系群体进行QTL 检测，在第5 号染色体上定位到了与果皮厚度相关主效QTL［34］。本研究利用SSR 标记方法结合复合区间作图法，在甜玉米的10 条染色体上检测出3个与果皮厚度相关的主效QTL，这与前人研究所得的玉米果皮厚度基因数1.4～5.9 个的结论相吻合［35］，其中位于第8 染色体的QTL（qPT-ch.8-1）与胡冲等［10］的研究结果比较接近，可能是同一QTL，结果有待进一步验证；
位于第5 染色体的2 个QTL（qPT-ch.5-1、qPT-ch.5-2）位置较接近，之后可进一步进行精细定位。本研究定位到的QTL 数目和位置与前人研究不尽相同，可能与试验材料的遗传背景、材料之间的遗传差异、作图群体、分子标记类型以及群体大小等不同有关。今后可进行不同时间、不同地点、不同群体的研究，补充不同环境条件及不同遗传背景下甜玉米果皮厚度的遗传模型及QTL 定位，为甜玉米的种质改良及分子辅助选择提供理论依据。

本研究以 薄果皮的甜玉米自交系T77 为母本配制杂交组合检测果皮厚度QTL，检测到的3个果皮厚度QTL 遗传效应以加性为主且均为负值，表明降低果皮厚度的QTL 来源于薄果皮的亲本T77。在今后的分子育种实践中，应通过辅助选择薄果皮亲本的等位基因实现果皮性状的遗传改良。

本研究对甜玉米果皮厚度进行了初步定位，检测的QTL 标记区间较大，尚难以有效利用。下一步将结合玉米基因组序列信息，在主效QTL 标记区间内加大分子标记密度、扩大群体，找到与QTL 紧密连锁的分子标记，以期在育种实践中实现分子标记辅助选择。

本研究应用主基因+多基因遗传模型方法分析甜玉米果皮厚度的遗传模型，结果表明甜玉米的果皮厚度主要受1 对主基因控制遗传，主基因表现为加性及部分显性或超显性，以加性效应为主，主基因遗传率达69.10%；
通过构建SSR 分子标记遗传连锁图谱与甜玉米F2果皮厚度的测量数值结合分析，使用复合区间作图法在甜玉米第5、8 染色体上分别检测出3 个与果皮厚度相关的QTL。3 个QTL 的加性效应为负数，说明对果皮厚度有削弱作用。环境和微效多基因对玉米果皮厚度的影响较小，因此育种实践中应重视主基因。检测出的3 个QTL 的贡献率均大于10%，属于主效QTL，在育种实践时可重点关注甜玉米染色体上的这3 个QTL 的位置，以此更快对甜玉米的果皮厚度进行改良，提高育种的效率。

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