＊陶后怡 凌焰辉 袁满 唐嬉月 王圆圆 魏胜华

（安徽工程大学生物与食品工程学院 安徽 241000）

β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，E.C.3.2.1.21）又被称作为β-葡萄糖苷水解酶，它能够高效水解各类糖苷化合物中结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，从而释放出β-D-葡萄糖和相应的配基[1]。该酶在自然界中广泛存在，各类植物的种子，动物的肝脏、小肠等器官以及微生物中都存在β-葡萄糖苷酶[2-3]。

β-葡萄糖苷酶应用领域较多，包括纤维素资源开发、食品加工和糖苷类化合物的合成等方面[4-6]。植物来源的β-葡萄糖苷酶具有多种多样的功能，特别是其能够耐受较高浓度的葡萄糖，使其应用远比微生物来源的β-葡萄糖苷酶广泛和更有价值。目前商品化的β-葡萄糖苷酶主要来自于苦杏仁，价格及其昂贵。许多研究者探寻从其他植物的种子中去获取β-葡萄糖苷酶[7-8]。

三相分离是一种较新的蛋白质分离纯化技术，目前在蛋白、多糖以及生物活性成分的分离提取中有较多的应用。其有机相和含盐的水相与蛋白粗提物结合时，能有选择性地使目标蛋白悬浮在有机相与水相的中间层成为固相。三相分离确切机理到目前还没有完全阐明，但是人们普遍认为是盐离子浓度、Kosmotropy、渗透压应力和表面张力多种因素的综合效应[9-11]。该方法是一种简单、快速和易于放大的分离提取酶的方法，不同于硫酸铵盐析的分步多级沉淀和脱盐处理，也不同于柱层析的繁琐操作而造成成本较高，通过三相分离法可以从粗酶提取液中一步分离纯化而得到目的酶蛋白，并且能够达到较高纯度和较高收率[12-13]。为了高效和低成本获得具有较高酶活力的β-葡萄糖苷酶，本文在考察了不同植物种子中β-葡萄糖苷酶的基础上采用三相法从苹果籽中提取β-葡萄糖苷酶，优化了三相分离提取酶蛋白的条件，为规模化制备β-葡萄糖苷酶提供了新方法。

（1）材料与试剂。苹果籽和蓖麻籽购自当地种子公司；
苦杏仁，购自当地中药房；
榴莲籽、菠萝蜜籽，来自当地水果商店；
其他试剂购自国药集团上海化学试剂公司，均为分析纯。

（2）高活力β-葡萄糖苷酶的种籽的筛选。将所有的种籽先用自来水浸泡6h后剥壳自然风干粉碎，过200目筛。用预冷的丙酮洗涤2次脱脂风干后获得粗酶粉；
准确称取1.0g粗酶粉加入石英砂进行研磨，用0.05M的磷酸缓冲液（pH7.0）提取2次，合并提取液后离心10min后收集上清液，测定酶活。

（3）β-葡萄糖苷酶的三相法分离提取。取10mL的粗酶液，在室温条件下加入一定量研磨成粉末状的固体硫酸铵，使其饱和度为40%，振荡使其充分溶解，再加入同等体积的有机溶剂，调节pH为7.0，混匀，并静置1h，然后将混合体系在1000r/min条件下离心10min，使中间相被压缩成薄片状蛋白沉淀。上层的有机相和下层的水相用移液枪移走，收集中间沉淀相，即得提取的β-葡萄糖苷酶。然后用0.05M的磷酸缓冲液（pH7.0）溶解中间沉淀相，并对其酶活性和蛋白质浓度进行测定。在以上初始条件的基础上，分别对有机溶剂的种类和用量、硫酸铵的饱和度、提取的pH值和温度进行考察，获取最佳提取参数。

（4）酶活和蛋白含量的测定。β-葡萄糖苷酶的酶活的测定以硝基苯基-β-D-葡萄糖苷为底物采用比色法进行测定，以对硝基苯酚为标准产物，酶活的定义为：在pH7.0、45℃条件下，每分钟水解硝基苯基-β-D-葡萄糖苷产生1μmol对硝基酚（pNP）所需要的酶量定义为一个酶活力单位（U）[14]；
蛋白质含量的测定以牛血清白蛋白为标准蛋白，采用Bradford法进行测定[15]。

酶活回收率定义为纯化后酶所显示出的酶活力占初始粗酶酶活力的百分数，其计算公式如下：

纯化倍数定义为经纯化后酶的比酶活与初始粗酶比酶活的比值，其计算公式如下：

(1)高活力β-葡萄糖苷酶的植物种籽的筛选

植物的种籽中一般都含有β-葡萄糖苷酶，该酶可以与其他酶协同作用水解种籽中的淀粉生成葡萄糖用以提供其萌发阶段所需要的糖分，相比较微生物中广泛存在的β-葡萄糖苷酶，种子中的酶能够耐受较高的葡萄糖浓度，使其可以通过逆水解合成糖苷类活性化合物。本试验选取了市面上常见的几种植物的种籽，先通过浸泡，促使其酶的活性被激活，然后考察其酶活，试验结果如图1所示，由图中可以看出，酶活最大的是苹果籽，其次是苦杏仁，最差的是菠萝蜜的种籽，因此后续的试验就以苹果籽作为研究的对象。

图1 不同种籽中β-葡萄糖苷酶的活力

(2)三相分离条件的优化

①有机溶剂的选择。分别选取正丁醇、异丁醇、叔丁醇、正戊醇、乙腈等有机溶剂进行三相分离操作，测定纯化后的酶活力和蛋白浓度，计算酶活回收率和纯化倍数，试验结果如图2所示，由图可以看出，采用为正戊醇作为提取溶剂的效果最好，在三相法提取蛋白的过程中，虽然现在普遍使用的是叔丁醇，但是没有一定的绝对规律可循，基本上需要试验验证。

图2 不同有机溶剂对分离提取的影响

②正戊醇用量对提取的影响。正戊醇作为有机溶剂能够同硫酸铵共同作用将酶蛋白从粗提液中分离出来，但是其用量也影响着三相分离提取的效果，图3显示了不同正戊醇浓度下三相分离提取的效果，由图可以看出当提取液与正戊醇的比例为1.0:2.0的时候，三相分离的效果最好，这时候可以将大部分的酶蛋白聚集在中间层，酶的纯化倍数和酶活回收都较高。

图3 正戊醇用量对提取的影响

③硫酸铵饱和度对提取的影响。硫酸铵在三相分离的过程中起着盐析以及促使相形成的作用，由于带电离子的作用，蛋白质胶体颗粒表面的一部分电荷被中和，胶体颗粒之间互相排斥的力量减弱，胶体颗粒就会相互聚集，最后沉淀出来。图4显示了不同硫酸氨浓度下的三相分离的情况，由图可以看出，当硫酸铵的饱和度为70%的时候，其分离效果最好。

图4 硫酸铵饱和度对提取的影响

④pH对提取的影响。pH值影响蛋白的带电状态，中间层蛋白的表面电荷浓度影响盐析作用的效率，而盐析表面所带净电荷与体系的pH相关联，探究不同pH对三相分离β-葡萄糖苷酶的影响，结果如图5所示，由图中可以看出在pH值为5.0的时候，酶活回收率和纯化倍数最大，估计5.0在该酶的等电点附近。

图5 pH值对提取的影响

⑤温度对提取的影响。酶蛋白从溶液中汇聚到中间相呈固态析出的过程也是蛋白分布从无序到有序的过程，温度过低酶蛋白的呈相时间越长，且长时间与有机溶剂接触影响酶的活性，造成目标蛋白变性失活。温度过高容易造成固液界面酶蛋白的溶解，使酶蛋白难以沉淀下来形成中间相，导致损失大量的酶蛋白，影响目标蛋白酶的纯化倍数；
此外，过高的温度也会影响酶的活性。因此考察了不同温度对三相分离的影响并从中找出三相分离体系的最适温度，结果如图6所示，由图可以看出最佳提取温度是35℃。

图6 温度对提取的影响

(3)提取结果分析

由上述试验结果可知，三相法从苹果籽中分离提取分离β-葡萄糖苷酶的最佳条件为：以正戊醇为有机溶剂，其与粗酶液的体积比为2.0:1.0，硫酸氨的饱和度为70%，提取体系的pH值为5.0，提取温度为35℃，在此条件下在25mL离心管中进行三相提取的操作，其中所有的苹果籽的起始量为1.0g，试验结果如表1所示。

表1 三相法分离β-葡萄糖苷酶的结果

由表1可知，通过三相法，最终β-葡萄糖苷酶的纯化倍数和酶活回收率分别为7.51%和88.68%，纯化效果良好。

三相法分离蛋白具有简便和高效的特点，在酶活筛选的基础上，选用苹果籽作为提取β-葡萄糖苷酶的原料，结果表明以正戊醇为有机溶剂，当粗酶液与正戊醇体积比为1.0:2.0，硫酸铵的饱和度为70%，pH值为5.0，提取温度为35℃时，提取效果最好，最终纯化倍数可达7.51，酶活回收率为88.68%，本研究为规模化制备β-葡萄糖苷酶提供了新方法。

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