邱琼华，毛桂福，梁学政，韦倩，李隽永，覃世逆

1.柳州市中医医院药学部，广西 柳州 545001；
2.广西医科大学第四附属医院检验科，广西 柳州 545005

肝癌是目前我国第4位常见恶性肿瘤及第2位肿瘤致死病因，严重威胁我国人民的生命和健康，主要包括肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）、肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）和HCC-ICC混合型3种不同病理学类型，其中HCC占85%～90%，是肝癌最常见的类型[1]。目前肝癌的早期治疗以外科手术为主，中晚期则主要运用局部消融、放射及系统治疗等手段，有一定局限性，不良反应较多。研究发现，传统医学与现代医学结合运用于肝癌治疗的不同阶段，能够起到增效减毒，提升患者生存率及改善患者生活质量的目的[2]。

在中医学中，肝癌归属于“积聚”“肝积”“黄疸”“鼓胀”“暴症”等病的范畴，“肝藏血，主疏泄”，中医认为情志郁结将导致肝气疏泄无权，易气郁化火，故肝癌后期容易出现肝热血瘀之象，治疗上宜清热化瘀。山慈菇味甘，性辛凉，归肝、脾经，有清热解毒，化痰散结之功，《本草拾遗》曰：“山慈菇尤擅疗痈肿疮瘘，瘰疬结核”等；
半枝莲味辛苦，性寒，归肺、肝、肾经，有清热解毒，化瘀止血的功效，临床上二者常共同用于肝癌的治疗[3-5]，如林丽珠、尹常健常使用该药对治疗热毒炽盛的肝癌患者，疗效明显。现代研究显示，山慈菇主要含有菲类、联苄类、多糖类以及甾体类化合物，能抑制肿瘤细胞的增殖和转移[6-7]。半枝莲主要含有黄酮类、二萜及其内酯类成分，是公认的抗癌中药，在肝癌、卵巢癌、结直肠癌、肺癌、白血病等多种癌症治疗中有显著的效果[8]。但二者以药对联合使用的抗肝癌研究未见报道，其抗肝癌的作用靶点及机制尚需进一步阐明。基于此，本文利用网络药理学方法构建“山慈菇-半枝莲”的“活性成分-疾病-靶点-通路”的网络，分析“山慈菇-半枝莲”的核心活性成分及抗肝癌的潜在作用靶点，为深入研究“山慈菇-半枝莲”的抗肝癌机制提供科学依据。

1.1 “山慈菇-半枝莲”活性成分及靶点的筛选

以“山慈菇”“半枝莲”为关键词，在中药系统药理学分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http://lsp.nwsuaf.edu.cn/）检索两药物的化学成分，收集其药物动力学参数，以口服生物利用度（bioavailability，OB）≥30%，药物相似性（druglikeness，DL）≥0.18作为活性化合物的筛选标准[9]，获得“山慈菇-半枝莲”活性化合物。之后运用TCMSP筛选出活性化合物的靶点基因，并借助UniProt数据库将靶基因全称转换为通用简写，去除无靶点的化合物，得到“山慈菇-半枝莲”活性成分的对应靶点数据。

1.2 药物-疾病共同靶点的筛选及PPI网络图的构建

在Genecards数据库（https://www.genecards.org/）和OMIM数据库（https://omim.org/）用关键词“liver carcinoma”进行检索及筛选，获取肝癌相关疾病靶点。然后将“山慈菇-半枝莲”活性成分靶点与肝癌相关靶点进行映射构建韦恩图，提取共同的靶基因，将交集靶基因上传到String网站（https://string-db.org/），运用软件中的“Multiple Proteins”项，设置蛋白相互作用最低分数为0.7进行筛选分析，构建蛋白互作网络（protein-protein interaction，PPI）。

1.3 核心靶基因的筛选

将1.2的PPI结果导入cytoscape软件，结合软件中的Deg（degree）、MCC（maximal clique centrality）、DMNC（density of maximum neighborhood component）、EPC（edge percolated component）、BC（Betweenness）、Clo（Closeness）六种算法[10]，获得六种算法中各排列前50的靶基因，构建韦恩图，取其交集靶基因，即为“山慈菇-半枝莲”抗肝癌的核心靶基因。

1.4 靶点基因功能注释和通路富集分析

通过DAVID软件（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）和R软件的ClusterProfiler数据包对筛选出的共同靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析，以P＜0.05作为差异有统计学意义的筛选条件，得到“山慈菇-半枝莲”抗肝癌的生物过程及相关信号通路，并对其进行可视化处理。

1.5 构建“药物-活性成分-靶点”网络

运用软件Cytoscape构建“药物-活性成分-靶点”关系网络以阐明“山慈菇-半枝莲”中活性成分与疾病靶点的关系。以网络下方方形节点代表筛选后“山慈菇-半枝莲”与肝癌的共同靶基因，网络上方椭圆形节点代表“山慈菇-半枝莲”的活性成分，连接线代表“山慈菇-半枝莲”活性成分与潜在作用靶点的相互关系。

2.1 “山慈菇-半枝莲”活性成分分析

通过TCMSP数据库检索到“山慈菇-半枝莲”已报道的化学成分112个，经筛选后共得到山慈菇化合物3个，半枝莲化合物29个，有相同化合物2个，共得到30个潜在活性成分，详见表1。

表1 “山慈菇-半枝莲”主要活性成分Table 1 Main active ingredients of PC-SB

2.2 药物-疾病共同靶点的筛选及PPI网络图的构建

2.2.1 药物-疾病共同靶点的筛选

通过Genecards数据库和OMIM数据库的检索，获取肝癌相关的疾病靶基因分别为16 368和437个；
“山慈菇-半枝莲”的30个活性成分对应的靶基因去重后为194个，运用R软件将194个活性成分靶基因与16 623个肝癌相关靶基因进行交集并构建韦恩图，得到交集靶基因192个，即“山慈菇-半枝莲”潜在抗肝癌作用靶点，见图1。“山慈菇-半枝莲”的靶基因几乎全部与肝癌靶基因关联，表明该药对能精准作用于肝癌相关靶点。

图1 “山慈菇-半枝莲”活性成分与肝癌共同靶点韦恩图Figure 1 Venn diagram of the common target of PC-SB and liver carcinoma

2.2.2 PPI网络图的构建

将上述192个共同靶基因上传至String平台，物种设定为“homo sapiens”，其余参数默认，获得蛋白相互作用数据信息，得到由192个节点及1 281条边组成的PPI网络，见图2。

图2 “山慈菇-半枝莲”与肝癌的共同靶蛋白相互作用网络图Figure 2 PPI network of the common targets between PC-SB and liver carcinoma

2.2.3 核心靶基因的筛选

在上述基础上通过cytoscape的cytohubba插件，运用Deg、MCC、DMNC、EPC、BC、Clo六种算法，分别获取各算法前50位的靶基因。其中Deg算法获取的前5个靶基因是：AKT1、MAPK1、JUN、IL6、VEGFA；
MCC算法获取的前5个靶基因是：IL6、CXCL8、JUN、IL-1B、CCL2；
DMNC算法获取的前5个靶基因是：CHRM4、OPRM1、IL1A、IL2、ERBB3；
EPC算法获取的前5个靶基因是：MAPK1、JUN、AKT1、IL6、EGFR；
BC算法获取的前5个靶基因是：AKT1、APP、JUN、MAPK1、IL6；
Clo算法获取的前5个靶基因是：AKT1、 MAPK1、 JUN、 IL6、 VEGFA。

再通过jvenn软件对各算法获取的靶基因取交集，得到PTGS2、CXCL8、IL4、IL-1B、HMOX1和IL10等6个关键靶基因，见图3。

图3 六种算法靶基因交集韦恩图Figure 3 Venn diagram of target gene intersection of six algorithms

2.3 GO功能注释及相关通路富集分析

2.3.1 共同靶基因的GO功能富集及注释

在线david分析结果显示，药物-肝癌共同的192个靶基因涉及了603个生物过程、65个细胞组分和131个分子功能。在生物过程方面主要涉及对药物的反应、聚合酶Ⅱ启动子转录的正向调节、转录的正向调节、细胞老化、无配体时外源性细胞凋亡等；
在细胞组分方面主要涉及胞外空间、细胞质、膜筏、核质、线粒体外膜、细胞质核周区的调控等；
在分子功能方面主要有酶结合、蛋白质结合、RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性、转录因子结合、血红素结合等。

另通过R软件的clusterProfiler GO数据包对以上基因功能进行GO生物功能注释，并以P＜0.05作为评判标准筛选得到175条结果，对其排名前20的生物功能进行可视化分析，得到GO分析气泡图，见图4。结果显示，共同作用的靶基因主要富集在与结合DNA的转录因子结合（DNA-binding transcription factor binding）、与结合DNA的特异性RNA聚合酶Ⅱ的转录因子结合（RNA polymerase Ⅱ-specific DNA-binding transcription factor binding）、信号受体激活酶的活性（signaling receptor activator activity）、细胞因子受体结合（cytokine receptor binding）、受体配体活性（receptor ligand activity）、泛素样蛋白连接酶结合（ubiquitin-like protein ligase binding）等功能上，涉及基因的转录及蛋白的降解、肿瘤微环境、肿瘤炎症反应、肿瘤免疫抑制以及肿瘤血管生成等生理功能。

图4 GO功能富集分析图Figure 4 Visual analysis of GO function enrichment

2.3.2 KEGG通路富集分析

应用R软件中Cluster Profiler KEGG数据包对共同靶基因进行KEGG通路富集分析，根据保留P＜0.05的结果，共富集得到162个信号通路，对其前20个富集结果进行可视化分析，得到KEGG分析柱状图，见图5。结果如图所示，AGE-RAGE信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、乙型肝炎信号通路（Hepatitis B）、白介素-17信号通路（IL-17 signaling pathway）、肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）、丙型肝炎信号通路（Hepatitis C）、PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、肝细胞癌信号通路（Hepatocellular carcinoma）等为“山慈菇-半枝莲”治疗肝癌的关键信号通路。此外，NF-kB信号通路（NF-kappa B signaling pathway）、P53信号通路、MAPK信号通路、血管内皮生长因子信号通路（vascular endothelial growth factor signaling pathway，VEGF signaling pathway）、EGFR信号通路、膀胱癌通路、前列腺癌通路、小细胞肺癌、乳腺癌等通路也被显著富集。

图5 KEGG通路富集分析Figure 5 Visual analysis of KEGG pathway enrichment

2.4 “药物-活性成分-疾病靶点”网络图构建

将“山慈菇-半枝莲”的活性成分与共同靶点及其属性导入到Cytoscape，构建“药物-活性成分-靶点”网络，见图6。根据Deg排名，选取关联靶基因数量超过20的活性成分，分别为槲皮素、木犀草素、汉黄芩素、黄芩素、β-谷甾醇、胡萝卜苷以及4，7-二羟基-2-甲氧基-9，10-二氢菲，是抗肝癌的关键活性成分，其与多个靶基因相关联，见表2。

图6 “药物-活性成分-靶点”网络图Figure 6 “Drug-component-target”network

表2 “山慈菇-半枝莲”核心化合物与相关靶基因信息Table 2 Core active ingredients and related target gene information of PC-SB

肝癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一，其中乙肝病毒引起的慢性肝损伤是肝癌发生的主要因素，此外丙型肝炎病毒感染、乙醇滥用、黄曲霉毒素食物摄入、非乙醇性脂肪肝损伤等均是肝细胞癌发生的病因[11]，近年来有关肝癌的发病机制研究显示，肝癌的发生与多种基因调控的各种细胞信号通路、外泌体、Toll样受体、自噬等有关[12-13]。本研究通过网络药理学的方法探讨“山慈菇-半枝莲”治疗肝癌的潜在靶点及作用机制，筛选出“山慈菇-半枝莲”活性成分30个，肝癌靶点192个，涉及162个信号通路，进一步筛选得出核心化合物7个，核心靶基因6个，GO富集结果显示肝癌靶基因主要参与DNA转录和蛋白降解、炎症反应、免疫抑制以及血管的生成等生理功能，涉及AGE-RAGE信号通路、乙型肝炎信号通路，IL-17、TNF、PI3K-Akt、NF-kB等信号通路，体现了“山慈菇-半枝莲”多成分、多靶点、多途径治疗肝癌的特点。具体如下：

本研究通过“药物-活性成分-靶点”图，获得“山慈菇-半枝莲”抗肝癌的7个核心活性成分，分别为槲皮素、木犀草素、汉黄芩素、黄芩素、β-谷甾醇、胡萝卜苷以及4，7-二羟基-2-甲氧基-9，10-二氢菲等，其中槲皮素、木犀草素、汉黄芩素、黄芩素等均属于黄酮类化合物，研究显示槲皮素可抑制IL-1β、IL-6、IL-10和诱导型一氧化氮合酶的合成，从而抑制PI3K/Akt/NF-κB和STAT3等通路以减少肝脏炎症反应，降低肝癌发生率[14]；
汉黄芩素能通过能抑制EGFR系列信号通路的磷酸化而抑制新生血管的生长，从而抑制肝癌细胞系的增殖和侵袭[15]；
黄芩素能抑制肝癌移植瘤的生长，诱导细胞凋亡，其作用机制与调控PI3K-AKT通路有关[16]，且黄芩素还能影响细胞增殖、转移、凋亡和自噬等多种生物过程而发挥抗癌活性[17]，综上推测“山慈菇-半枝莲”药对可能主要通过上述7个核心活性成分发挥抗肝癌作用，是该药对抗肝癌的主要物质基础。

本研究通过PPT网络拓扑图及Deg、MCC、DMNC等六种算法交集得到6个核心靶点，分别为PTGS2、CXCL8、IL4、IL-1B、HMOX1 和 IL10，它们是与细胞增殖、炎症相关的主要靶点。研究显示，在肝癌中炎症可直接促进肿瘤细胞的增殖与存活，且炎症能通过影响免疫调控使得肿瘤细胞逃脱免疫系统的监视。据报道，前列素内环氧化物合成酶2（Prostaglandin endoperoxide synthase 2 PTGS2）在人类许多良性癌前病变和恶性肿瘤中均有高表达，抑制肝癌细胞内的PTGS2能使其线粒体功能发生障碍而导致细胞凋亡[18]；
HMOX1（Heme Oxygenase 1）属于血红素加氧酶家族，高表达的HMOX1与肝癌细胞的转移和不良预后密切相关[19]；
CXCL8、IL4、IL-1β和IL10均属于白介素家族，在多种类型的肿瘤中均发现它们的过度表达现象，这种过表达能促进肿瘤的生长、侵袭转移、耐药、炎症反应及血管新生等进程[20-22]，已有研究报道肝癌组织中IL4、IL10等的升高使得机体中Th1/Th2比例的失衡，导致肿瘤免疫耐受的发生[23-24]；
类似的IL-1β在肝癌细胞表达异常升高时，能够削弱机体NK细胞天然免疫应答，造成肝癌细胞的免疫逃逸。以上分析结合本文GO功能富集结果，推测“山慈菇-半枝莲”的活性成分主要通过抑制PTGS2、HMOX1、IL4等核心靶点的过表达，影响DNA、RNA转录因子的结合、调节信号受体激活酶的活性、介导基因的转录及蛋白降解，参与肿瘤微环境、炎症反应、血管生成等生理功能，最终抑制肝癌细胞的生长、转移和侵袭。

为进一步分析“山慈菇-半枝莲”抗肝癌的作用机制，对KEGG富集的信号通路进行分析，发现“山慈菇-半枝莲”能调节多种信号通路发挥抗肝癌作用，其中与肿瘤增殖、转移，肿瘤微环境，促进血管新生的PI3K-Akt、IL-17、TNF、NF-κB、VEGF、P53、MAPK等信号通路被显著富集。已有证据显示PI3K-Akt信号通路与肿瘤细胞的增殖、粘附、迁移以及肿瘤血管生成密切相关，该通路在许多肿瘤细胞中均发现被高度激活，其中肝癌细胞中高表达的四跨膜蛋白CD151可激活PI3KAkt信号通路，加快肿瘤血管形成、促进肝癌细胞的侵袭和转移[25]，而活化的PI3K-Akt还可通过TSC1/2复合物进一步激活下游mTOR蛋白激酶，促使nPKCd的磷酸化，从而加速蛋白质的合成，促进细胞增殖。p53则是目前研究发现的最重要的肿瘤抑制因子之一，拥有细胞自噬和抑制细胞增殖的功能，据报道至少50%癌症患者中p53发生突变或者功能丧失[26]，突变后的p53除了失去野生型的肿瘤抑制功能外，通常还获得新的致癌功能。MAPK信号通路调节和参与细胞的生长发育和凋亡等过程，异常活化的MAPK能激活下游通路的蛋白激酶，促进肝癌细胞的增殖和迁移[27-28]。

近年来，炎症，特别是持续的慢性炎症，已经被证实在肝癌等肿瘤的发生、发展中具有重要作用。肿瘤微环境中存在着大量的炎症浸润细胞，这些细胞分泌的细胞因子和肿瘤之间相互作用，共同构成了复杂的肿瘤炎症微环境，影响着肿瘤的生物学进程。研究显示，在肿瘤炎症微环境中促炎因子TNF-α和抗炎因子如TGF-β、IL-4、IL-10等的含量比例失衡促进肿瘤细胞的免疫逃逸、生长和转移[29]。本研究中乙型肝炎、丙型肝炎、IL-17、TNF、NF-kB等多条信号通路被显著富集，显示“山慈菇-半枝莲”抗肝癌的作用与调节炎症反应密切相关。研究显示多数炎症因子通过激活NF-κB通路发挥作用，如TNF-α、IL-1等信号因子可激活NF-κB通路，诱导多种趋化因子和黏附因子的表达，扩大炎症反应，为肿瘤细胞创造有利的生长的微环境[30]。在肝细胞癌发生发展过程中，许多因素都可能激活NF-κB信号通路，促进细胞增殖与抗凋亡、加速血管生成、浸润等生理过程。此外，乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒慢性感染后的炎症微环境是肝癌发展的重要因素，研究显示HBV和HCV感染导致的HCC占全球HCC病例数的80%左右[31]。

此外，在肿瘤组织中，肿瘤细胞维持其异常生长的重要途径是促进血管新生，VEGF、Wnt/βcatenin（Wnt/β-连环蛋白通路）、PI3K-AKT等多个信号通路参与该过程，对血管新生的各个阶段产生影响。其中VEGF联系众多信号通路，对血管新生的过程发挥了不可替代的作用[32]。VEGF是机体内常见的同源二聚体糖蛋白，也是目前发现对血管生成具有最强促进作用的因子，当VEGF/VEGFR通路激活后，完成下游信号通路传导，促进原有血管基础上的有丝分裂，增加血管通透性，促进新生血管的生长。大量研究显示，VEGF和VEGFR在肝癌组织中表达明显增多，在肝癌的生长和转移中起关键性作用。

综上所述，肿瘤的发生与发展涉及多个靶点，多种信号通路的相互作用，“山慈菇-半枝莲”的活性成分正是通过调节上述关键靶点，阻断异常激活的信号通路，抑制相关基因的转录及蛋白降解、影响细胞因子受体、受体配体、泛素样蛋白等因子的活性，从而抑制肝癌细胞增殖、侵袭和转移，调节肿瘤炎症微环境，抑制肿瘤组织血管新生，最终发挥抗肝癌的作用。山慈菇、半枝莲是临床常用的抗肿瘤中药，使用范围涉及肺癌、肝癌、大肠癌等多种癌症，现代药理研究显示，山慈菇中的生物碱能抑制肿瘤细胞有丝分裂和增殖，山慈菇多糖可诱导肿瘤细胞的凋亡[33-34]；
半枝莲的水提物则能抑制大鼠肝癌的恶化，其总黄酮可诱导肿瘤细胞的自噬和凋亡[35-36]，本文通过网路药理学研究，对“山慈菇-半枝莲”抗肝癌的作用机制进行了探索研究，筛选出“山慈菇-半枝莲”药对的抗肝癌的主要活性成分，进一步明确了其抗肝癌的关键靶点和作用通路，为后续深入研究其抗肝癌的机制提供理论依据，其中部分通路的调控作用已在上述文献研究中得到证实，将来需进一步对其他靶点和通路进行实验验证，以获得更为直接的数据支撑。

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