杨雨晴 ，李树东 ，孙晓莹 ，陈小燕 ，白永飞 ，李颖 ，蔡昌福 ，余丽芸 ，侯喜林

（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319；
2.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院）

产肠毒素性大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）是初生仔猪腹泻和死亡的主要原因，由于发病早、发病急，如不及时治疗，将会给养猪业造成巨大的经济损失[1-2]。ETEC 的特征是可以产生两种类型的毒力因子，促进与特定肠上皮细胞受体结合和定植的菌毛黏附素和负责液体分泌的肠毒素[3-4]。ETEC 表达的菌毛通过与小肠肠上皮细胞刷状缘上存在的特定受体的相互作用介导黏附到宿主肠上皮，在细菌大量增殖的过程中产生肠毒素，引起胃肠道分泌大量电解质和水，从而导致仔猪腹泻[5-6]。黏附素的黏附作用是ETEC 感染的第一步，起了关键性作用。引起仔猪腹泻的ETEC 常携带黏附素K88、987P，也是研制基因工程疫苗的首选抗原。

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）革兰氏阳性细菌，公认的绿色安全级（generallyregarded as safe，GRAS）益生微生物[7]，被广泛地应用在食品、医药、饲料工业等方面[8]。乳酸菌具有益生作用和免疫佐剂作用，同时乳酸菌表达系统操作简便，这些特点使得乳酸菌适合作为外源蛋白的递呈工具[9]。而且乳酸菌可以通过黏膜途径进行免疫接种，提高了对以黏膜途径为主要途径侵入机体的病原体的保护性[10-11]。因此，乳酸菌在抗原蛋白的呈递方面比其他基因工程菌株更有优势，可以表达多种病原微生物抗原及生物活性分子来防治动物疾病，是开发新型活载体疫苗的理想选择。

研究构建共表达ETEC 987P 基因和K88 基因的重组干酪乳杆菌，鉴定了重组干酪乳杆菌的反应原性，并通过灌胃的方式免疫BALB/c 小鼠，采用检测血清中IgG 水平、肠冲洗液sIgA 水平、淋巴细胞增殖试验和攻毒保护性试验，评价其免疫效果。

1.1 材料

干酪乳杆菌CICC 6105 购自中国工业微生物菌种保藏中心；
5~6 周龄SPF 级BALB/c 小鼠购自长春市宽城区宏达动物养殖场，许可证编号为SCXK（辽）2020-0001；
ETEC C83916（987P）菌株和 C83902（K88）菌株由黑龙江八一农垦大学动物传染病诊断与新型疫苗实验室保存；
穿梭载体pLA、pLA-987P/L.casei、pLA-K88/L.casei 由黑龙江八一农垦大学基因工程实验室保存；
羊抗鼠IgG 抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；
DNA 提取液购自Solarbio 公司；
限制性核酸内切酶、T4 DNA 连接酶购自TaKaRa 公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成

根据GenBank 公布的ETEC 987P 菌毛基因序列（Access number：M35257.1）及 ETEC K88 菌毛基因序列（Access number：M29375.1）设计引物，引物由生工生物工程上海（股份）有限公司合成，引物信息见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.2 987P、K88 基因的扩增及克隆质粒的构建

以 ETEC 987P 和 ETEC K88 基因组 DNA 为模板，20 μL PCR 体系扩增目的基因，PCR 反应条件：94 ℃ 变性 5 min；
60 ℃ or 56 ℃退火 45 s（987P 60 ℃退火；
K88 56 ℃退火），72℃ 延伸 1 min，共 30 个循环；
72 ℃延伸10 min。将PCR 鉴定正确的目的片段回收后，分别连接至pMD18-T 载体，构建质粒pMD18-T-987P 和pMD18-T-K88，经PCR 及双酶切鉴定后，送往生工生物工程上海（股份）有限公司进行测序。

1.2.3 重组质粒pLA-987P-K88 的构建及鉴定

将 pMD18-T-987P 及 pLA 空载体用 BamH I、Sal I 双酶切后回收目的片段。首先将胶回收的987P片段和pLA 载体片段连接并转化至DH5α 感受态细胞，对鉴定阳性的重组质粒pLA-987P 和pMD18-TK88 进行Sal I、Hind III 双酶切处理，将酶切回收的pLA-987P 和 K88 片段连接并转化至 DH5α 感受态细胞，经PCR、双酶切正确的重组质粒命名为pLA-987P-K88。

1.2.4 干酪乳杆菌感受态细胞的制备

干酪乳杆菌感受态细胞的制备方法参考李超等[12]。将干酪乳杆菌6105 接种于无抗性MRS 液体培养基，培养至OD600 约为0.5，冰浴30 min 后离心，用EPWB 溶液洗涤菌体3 次，离心后用EPB 重悬菌体。

1.2.5 重组质粒的电转化

pLA-987P-K88 阳性质粒加入冰冷的感受态细胞中，冰浴10 min，将含有质粒的感受态细胞吸入冰冷的1 mm 电击杯中，将电击杯放入电转仪中（2.2 kV，脉冲时间4 ms）电击，加入800 μL 无抗MRS（含10%蔗糖），全部吸入1.5 mL 离心管中，37 ℃厌氧静置培养3 h，离心后收集菌体混匀后涂布于氯霉素抗性（34 μg·mL-1）的 MRS 平板上，37 ℃厌氧培养至长出单菌落。

1.2.6 重组干酪乳杆菌pLA-987P-K88/L.casei 的鉴定

乳酸菌质粒提取方法参考张波等[13]。以提取的重组质粒pLA-987P-K88 为模板分别对987P 基因、K88 基因及987P-K88 进行PCR 扩增，对PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶分析。

1.2.7 重组干酪乳杆菌的Western blot 鉴定

将培养10 h 的阳性重组菌用溶菌酶处理（37 ℃、30 min）后离心，用 1×Loading Buffer 上样缓冲液重悬菌体，沸水煮10 min 后离心。将蛋白样品电泳后转膜以抗987P、K88 阳性血清为一抗，羊抗鼠IgG-HRP为二抗，Western blot 检测987P-K88 的表达。

1.2.8 重组干酪乳杆菌pLA-987P-K88/L.casei 表面展示的检测

将重组菌pLA-987P-K88/L.casei 和pLA/L.casei培养 10 h 后各取 1 mL，4 000 r·min-1离心 5 min，用无菌PBS 洗涤菌体3 次，离心后用含5% BSA 的PBS 4 ℃封闭过夜，离心后用PBS 洗涤菌体3 次，离心后以抗 987P、K88 阳性血清（1∶50 稀释）作为一抗，37 ℃孵育 2 h，用 FITC 标记的羊抗鼠 IgG（1∶100 稀释）37 ℃避光孵育1 h，每次换液前用PBS 洗涤菌体3 次，检测前dd H2O 洗涤菌体1 次，调整菌体数目到5×106CFU·mL-1，300 目过滤网过滤除去杂质，流式细胞仪检测菌体发光情况。

将上述处理好的菌液吸取适量涂布于干燥载玻片上（75%乙醇浸泡过夜）并晾干，荧光显微镜下观察菌体荧光情况。

1.2.9 动物免疫实验及抗体检测

为比较免疫效果设立pLA-987P/L.casei 组和pLA-K88/L.casei 组，重组菌 pLA-987P/L.casei 和pLA-K88/L.casei 为实验室构建保存，重新活化后经质粒PCR 和Western blot 鉴定为阳性的菌株用于免疫小鼠。

取 250 只 BALB/c 雌鼠分成 6 组，pLA-987PK88/L.casei 组、pLA/L.casei 对照组、生理盐水对照组（NS）和空白对照组（Untreated）每组45 只。因pLA-987P/L.casei 组和pLA-K88/L.casei 组攻毒试验只攻一种ETEC 菌株，所以这两组每组35 只。

其中 pLA-987P-K88/L.casei 组、pLA-987P/L.casei 组、pLA-K88/L.casei 组和 pLA/L.casei 对照组小鼠均以 5×109CFU·mL-1灌胃 200 μL，NS 组灌胃相同体积的生理盐水，Untreated 组不做处理。每次连续灌胃5 d，间隔10 d 加强免疫，共免疫3 次。首免7 d 后随机选取小鼠眼球采血，采血后处死小鼠，取携带内容物的小肠，每间隔7 d 采集一次血和小肠，利用间接ELISA 方法检测血清中特异性IgG 抗体水平和肠道冲洗液的特异性sIgA 抗体水平。

检测结果用Graphpad prism 6 软件进行显著性分析，ns：P＞0.05；
*：0.01＜P＜0.05；
**：0.001＜P＜0.01；
***：0.000 1＜P＜0.001；
#：P＜0.000 1。

1.2.10 脾脏T 淋巴细胞检测

末免后每组随机选取3 只小鼠断颈迫杀，参照达科为生物技术有限公司小鼠淋巴细胞分离液的说明书制备小鼠淋巴细胞悬液，用1640 培养基（含10%胎牛血清）稀释细胞后，于96 孔板中进行培养，每孔大约6 000 个细胞，每组样品设3 个重复。各试验组用 987P-K88 蛋白（0.5 mg·mL-1）刺激，阴性对照组用1640 培养基（含10%胎牛血清）刺激，阳性对照组用ConA 刺激，为消除系统误差同时设立A 组（无细胞，刺激物和1640 培养液）和B 组（无细胞，仅含1640 培养液）。37 ℃ CO2培养箱中持续刺激24 h后，各孔加入10 μL CCK-8，作用1 h，用酶标仪检测OD450，计算刺激指数（stimulative index，S.I.）。

刺激指数=（试验组OD450-A 组OD450）（/阴性对照组 OD450-B 组 OD450）

1.2.11 攻毒保护性试验

（1）半数致死量的测定

5～6 周龄小鼠 72 只，随机分成组 A、B 两组，每组36 只，分别用来测定C83916（987P）和C83902（K88）的半数致死量（LD50），A、B 组又各分为 6 组，每组6 只，1～5 组为实验组，6 组为对照组。将大肠杆菌接种于LB 培养基，37 ℃震荡培养18 h，离心收集菌体，用灭菌蒸馏水稀释至 109CFU·mL-1，以 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 的剂量分别灌胃攻毒 1～5 组。观察并记录死亡数，应用Reed-Muench 法计算半数致死量。

（2）攻毒试验

末免14 d 后，每组各分为两部分，分别用3×103LD50的 C83916（987P）和 C83902（K88）对小鼠进行攻毒，空白对照组不做处理，攻毒方式为灌胃，攻毒后连续观察20 d，记录小鼠的发病和死亡情况，计算保护率。

免疫保护率（%）=（1-免疫组死亡率或发病率/对照组死亡率或发病率）×100%。

2.1 重组大肠杆菌 pMD18-T-987P/E.coli 和pMD18-T-K88/E.coli 构建

成功扩增出987P 基因和K88 基因，结果见图1A，1B；
重组质粒 pMD18-T-987P 用 BamH I 和 Sal I双酶切后可看到513 bp 的987P 基因和2 692 bp 的pMD18-T 载体条带；
用Sal Ⅰ和Hind Ⅲ 双酶切处理重组质粒pMD18-T-K88，可见789 bp 的K88 基因和2 692 bp 的pMD18-T 载体条带，结果如图1C，1D所示。

图1 重组大肠杆菌pMD18-T-987P/E.coli 和pMD18-T-K88/E.coli 构建Fig.1 Construction of recombinant Escherichia coli pMD18-T-987P/E.coli and pMD18-T-K88/E.coli

2.2 重组pLA-987P-K88/E.coli 的酶切鉴定

分别用 BamH I 和 Sal I、Sal I 和 Hind III、BamH I和Hind III 对PCR 鉴定为阳性的重组质粒 pLA-987P-K88 进行酶切处理，结果分别切出513、789 bp和1 302 bp 片段，与预期一致，结果见图2。

图2 重组质粒pLA-987P-K88 的鉴定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pLA-987P-K88

2.3 重组pLA-987P-K88/L.casei 的鉴定结果

从pLA-987P-K88/L.casei 提取重组质粒pLA-987P-K88，以其为模板进行PCR 扩增，结果显示大小约为513、789 bp 和1 302 bp 的片段，与预期一致，结果如图3A。用溶菌酶处理pLA-987P-K88/L.casei和 pLA/L.casei 后，进行 Western blot 鉴定，经 DAB 显色后，pLA-987P-K88/L.casei 在约 85 kDa 处出现条带，对照组未出现此现象，见图3B。间接免疫荧光鉴定结果显示，pLA-987P-K88/L.casei 与对照组在明视野下均能见到相应菌体，pLA-987P-K88/L.casei 荧光显微镜下可观察到明显的绿色荧光反应，而对照组未见到绿色荧光，见图3C。流式细胞仪检测结果表明，重组干酪乳杆菌的荧光强度明显高于对照组，表达量约为92.81%，结果如图3D。上述结果证明外源蛋白成功表达在干酪乳杆菌表面。

图3 pLA-987P-K88/L.casei 鉴定结果Fig.3 Identification results of pLA-987P-K88/L.casei

2.4 小鼠血清中IgG 抗体水平检测结果

应用间接ELISA 方法检测不同时间段的血清中IgG 抗体水平，试验结果如图4，首次免疫7 d 后pLA-987P-K88/L.casei 组 、pLA-987P/L.casei 组 和pLA-K88/L.casei 组抗体水平显著高于pLA/L.casei组、NS 组和 Untreated 组（P＜0.0001），pLA-987P/L.casei 组和pLA-K88/L.casei 组抗体水平略高于pLA-987P-K88/L.casei 组但没有显著差异（P＞0.05），抗987P IgG 抗体在49 d 达到峰值，抗K88 IgG 抗体在56 d 达到峰值。

图4 免疫小鼠血清抗体水平变化Fig.4 Changes of serum antibody levels in immunized mice

2.5 小鼠肠冲洗液中sIgA 抗体水平检测结果

应用间接ELISA 方法检测不同时间段的肠冲洗液中sIgA 抗体水平，试验结果如图5，首次免疫7 d后即可检测出抗体，重组干酪乳杆组菌与NS 组和Untreated 组相比呈明显的上升趋势，且抗体水平一直在上升，pLA-987P-K88/L.casei 组抗体水平略低于pLA-987P/L.casei 组和pLA-K88/L.casei 组但没有显著差异（P＞0.05）。

图5 免疫小鼠肠冲洗液抗体水平变化Fig.5 Changes of antibody levels in intestinal rinse solution of immunized mice

2.6 脾脏T 淋巴细胞增殖检测结果

末免后采集各试验组小鼠脾脏，分离淋巴细胞，试验组用987P-K88 蛋白刺激，结果显示，pLA-987PK88/L.casei 试验组刺激指数显著高于pLA/L.casei组、NS 组和Untreated 组，但987P-K88 蛋白的刺激指数整体低于ConA，如图6。

图6 脾脏T 淋巴细胞增殖结果Fig.6 Results of splenic T lymphocyte proliferation

2.7 攻毒保护性试验

末免14 d 后，对小鼠进行攻毒保护性试验，用C83916（987P）和 C83902（K88）（3×103LD50） 的对小鼠进行攻毒，攻毒后观察小鼠发病和死亡情况。pLA/L.casei 组和生理盐水组在攻毒之后出现精神萎靡不振、毛皮褶皱、食欲下降、活动呆滞、嗜睡最终死亡；
未攻毒的Untreated 组小鼠健康状态良好；
pLA-987P-K88/L.casei 组的保护率均在80%以上，说明口服重组菌有很好的保护效果。

表2 试验小鼠对C83916（987P）攻毒保护效果Table 2 Protective effect of test mice against C83916（987P）

表3 试验小鼠对C83902（K88）株攻毒保护效果Table 3 Protective effect of test mice against C83902（K88）strain

ETEC 的传播是由带菌母猪排泄物沾染到皮肤和乳头上，仔猪吃奶或者舔舐母猪皮肤，使ETEC 经口腔从胃肠道入侵机体。胃肠道分布有大量的淋巴细胞，尤其是胃肠道相关淋巴组织含有全身总淋巴细胞的70%，因此胃肠道成为体内最大的免疫器官[14]。黏膜在ETEC 传播和感染中的突出作用表明，直接黏膜免疫（例如口服）可能是一种通过诱导全身和黏膜免疫反应来预防ETEC 的有效策略。因此，开发能引起肠道的黏膜免疫的口服疫苗对防治ETEC 有着重要意义。

近年来随着黏膜免疫成为免疫学的研究热点，可引起黏膜免疫的活载体疫苗的兴起，乳酸菌以其益生作用、安全性且能在肠道定植等诸多优点走进了研究者的视野。实验室在利用乳酸菌表达抗原蛋白方面也做了很多尝试，证明了以乳酸菌制备ETEC活载体疫苗具备可行性。齐浩[15]制备的ETEC 987P基因工程乳酸菌口服免疫小鼠后，结果证明免疫效果良好；
魏春华等[16]构建的K99 重组乳酸菌能够抵抗ETEC K99 对小鼠的感染；
刘建奎等[17]采用了滴鼻和口服两种方式给小鼠表达ETEC F41 的重组乳酸菌，均为小鼠提供了良好的保护力。虽然实验室研究制备的单价乳酸菌疫苗免疫效果很好，但是防治范围有限，因此制备多价乳酸菌疫苗对ETEC 的防治更有利。多价疫苗能够克服ETEC 血清型多、毒力因子复杂的问题，防治范围更为广泛，在生产上减少了生产工序，也降低了生产成本，是ETEC 疫苗的重要发展方向[18]。

研究利用穿梭载体构建pLA-987P-K88 质粒，将阳性质粒电转进干酪乳杆菌，成功表达了大小为85 kDa 的融合蛋白，以小鼠为动物模型探讨重组干酪乳杆菌作为新型疫苗的潜在价值。IgG 是血清中免疫球蛋白的主成分，也是体液免疫应答产生的主要抗体，在抗感染、中和细菌毒素等方面发挥重要作用，是反映免疫功能的重要指标[19]。因此，实验将重组菌口服免疫小鼠后，检测不同时间血清中特异性IgG抗体水平，结果显示，首次免疫7 d 后即可检测到相应抗体，随着免疫次数和时间的推移，特异性IgG 抗体的水平也逐渐增高，末免结束一个月后抗体水平略微下降，pLA-987P-K88/L.casei 组的抗体水平始终显著高于对照组（P＜0.05），表明重组菌诱导机体产生体液免疫应答。

ETEC 从胃肠道入侵机体，因此肠道的黏膜免疫对防治ETEC 有着重要意义。黏膜系统是免疫防御的第一道防线，而sIgA 是黏膜免疫的第一道防线[20-21]。sIgA 可以阻止微生物黏附素与上皮细胞的相互作用，还可以通过直接识别受体结合结构域来特异性地抑制病原体，这使得sIgA 在病原体诱导的特异性免疫中有着不可或缺的作用[22]。实验在不同时间取口服免疫重组菌小鼠的肠道冲洗液，检测肠冲洗液中特异性sIgA 抗体水平，结果显示，重组菌组的抗体水平显著高于对照组，且抗体水平一直在升高，在首次免疫56 d 后增长的趋势才逐渐平缓，这表明该重组菌诱导机体产生肠道黏膜免疫应答。

为了进一步比较构建的二价重组干酪乳杆菌与单价重组菌的免疫效果，试验添加了pLA-987P/L.casei 免疫组和pLA-K88/L.casei 免疫组，免疫程序和剂量与pLA-987P-K88/L.casei 免疫组一致，结果显示pLA-987P/L.casei 组和 pLA-K88/L.casei 组的 IgG 抗体的水平和sIgA 抗体水平均比pLA-987P-K88/L.casei 组高。这与Wen L J 等[23]制备的重组乳酸菌疫苗相关实验结果相一致，刘欢欢[24]在NDV F、IBV S1 二联乳酸菌疫苗的相关研究中也得到了相似的结果。其原因可能是融合表达两种抗原蛋白分子量变大了，表达量有所下降，在免疫相同剂量时所含抗原量减少，所以刺激机体产生的免疫应答不如单个抗原蛋白强烈；
也可能是蛋白在折叠过程中，部分抗原表位被空间结构遮挡住了，导致其免疫原性降低。虽然重组干酪乳杆菌pLA-987P-K88/L.casei 组与pLA-987P/L.casei 和 pLA-K88/L.casei 相比 IgG 和 sIgA 的水平略低，但是攻毒保护性试验结果表明重组干酪乳杆菌足以抵抗ETEC C83916（987P）株和C83902（K88）株的攻击，且保护率均在80%以上。

T 淋巴细胞增殖试验又称T 淋巴细胞转化试验。T 淋巴细胞在体外经某种物质刺激，细胞代谢和形态相继变化，产生一系列增殖的变化，由淋巴细胞转变为淋巴母细胞[25-26]。淋巴细胞的增殖能力反映了机体免疫水平的强弱，据此可判断出淋巴细胞对有关刺激的反应性与功能状态，是测定机体免疫功能的指标之一[27]。研究T 淋巴细胞增殖试验结果显示重组菌pLA-987P-K88/L.casei 组刺激指数显著高于对照组，表明该重组菌能够诱导细胞免疫应答，同时，pLA/L.casei组刺激指数略高于生理盐水对照组（NS）和空白对照组（Untreated），该结果符合与乳酸菌的相关研究结论[28-30]。

成功构建了表达ETEC 987P 和K88 蛋白的重组干酪乳杆菌，重组干酪乳杆菌不仅能诱导小鼠产生体液免疫应答和细胞免疫应答，还能产生局部黏膜免疫应答，能够有效的抵抗ETEC 987P 和ETEC K88 的感染。

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