王思媛 杨慧然 翁本锐 冉家兵 王慧敏 杨昌英 邓张双

(1.三峡大学 天然产物研究与利用湖北省重点实验室,湖北 宜昌 443002;2.三峡大学 生物与制药学院,湖北 宜昌 443002)

核酸是由核苷酸组成的生物大分子,广泛存在于动植物细胞和微生物体内,是生命最基本的物质之一.核酸大分子分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA),是生物的基本遗传物质,核酸也可以用作生物研究和医学诊断的重要标志物.其独特的结构和功能性质使核酸在生物分析、核酸纳米技术和纳米医学方面有着巨大的应用前景.在检测方面,通过对特定靶标进行信号扩增,实现对金属离子、小分子和蛋白质等分析物的高灵敏度和高特异性的检测.

在核酸检测方面,聚合酶链式反应(PCR)[1]是最常用的扩增技术.然而,复杂的温度循环和操作过程极大地限制了PCR 在细胞、生物体内的实时分析应用.恒温核酸扩增反应具有在常温下快速、高效的扩增能力,已经成为一种有前景的扩增方法.然而,大多数恒温核酸扩增技术都需要蛋白酶的参与.但是蛋白酶易降解,需要严格的储存条件,对扩增效率产生影响.所以迫切需要开发基于恒温无蛋白酶的核酸扩增反应的生物传感器.目前这类生物传感器主要有以下几种:基于熵驱动反应(entropy-driven reaction,EDC)、杂交链式反应(hybridization chain reaction,HCR)、催化发卡自组装反应(catalyzed hairpin assembly,CHA)以及具有剪切活性或类辣根过氧化物酶催化活性的核酸酶(DNAzyme)的生物传感器.这些生物传感器被广泛应用于荧光、比色以及电化学检测,而且可以实现核酸、蛋白质、小分子和细胞等分析物的检测,同时也广泛应用于活细胞成像、活体成像等方面.本文对这几种方法分别进行了详细的介绍.

在核酸信号的扩增策略中,熵驱动反应(EDC)被认为是DNA 反应领域的一个里程碑[2].EDC 于2007年由Zhang等[3]首次提出.这种催化反应由多条线性单链DNA 组成,通过目标物引发由熵驱动的立足点介导的链置换反应(TMSDR),释放出多个寡核苷酸.EDC由额外释放的分子的熵增加驱动,与杂交链式反应(HCR)和催化发卡自组装(CHA)等这些基于发卡的反应相比,EDC 反应不涉及亚稳态DNA发卡结构,序列限制更少,而且由于EDC不需要复杂的发卡茎环二级结构的DNA 反应物,大大降低了随机碰撞和亚稳态发卡结构相互作用的机会,从而减少了背景信号.因此,EDC 具有快速、简单、稳定和易于模块化的优点.EDC在开发分子纳米机器、逻辑反应和计算等多种动态分子器件方面显示出独特的优势.

EDC的设计原理如图1所示[4],EDC 由5个功能单链DNA 组成.底物复合物(底物,S)首先由3条核酸链杂交形成,即连接链(LB)、输出链(OB)和信号链(SB).催化剂C 首先通过立足点结构域5与底物复合物S结合,并通过TMSDR 取代SB,使中间体I3的立足点结构域3暴露.随后,燃料链(F)与中间体I3杂交,并从LB中置换出OB,进而置换出C,形成不会参与后续反应的双链(W).此时,游离的催化剂C 可以引发新的催化组装循环,产生大量特定的寡核苷酸和双链DNA.与生物有机体中催化的传统观点不同,该反应由额外释放的分子的熵驱动,不需要蛋白酶,也不会改变共价键.

图1 EDC原理图[4]

以纳米粒子为载体,可以进一步增大体系的稳定性和反应物的利用率.比如Liang等开发了一种基于金纳米粒子(Au NPs)的EDC 驱动的3D DNA 行走机器人,用于细胞内miRNA 成像[5],如图2所示.目标miRNA 诱导行走臂与固定有高密度DNA 底物的Au NPs相连,从而触发EDC 并驱动行走臂在DNA轨道上逐步行走,最终将大量信号链释放,产生扩增的荧光信号.这种纳米机器的检测限达到8 pM,在活细胞中同样表现出良好的灵敏度.

除了用纳米粒子作为载体之外,还可以将四面体作为EDC反应的载体,例如He等提出了一种miRNA 触发熵驱动的活细胞三维DNA 扩增(EDTD)策略[6].如图3所示,通过目标miRNA 与EDTD 的相互作用,借助熵驱动方式特异性地启动一个自发的DNA 反应,并通过独特的DNA 四面体框架结构,显著地提高生物稳定性和内吞效率.该EDTD 的检测限为3.3 pM,比传统分子信标和线性杂交探针低约3个数量级.因此,这种可编程的DNA 机器实现了显著的荧光信号放大和对miRNA 的超灵敏检测.还为检测活细胞内的其他生物标志物提供了一种简便和通用的扩增策略.

图3 基于EDC的DNA 四面体框架扩增策略[6]

EDC反应还可以应用于电化学检测[7],如图4所示.首先通过Au-S键在金电极表面自组装形成三链DNA 复合物以制备DNA 燃料分子机器.miRNA-21作为催化剂启动EDC反应,通过第一个TMSDR,使miRNA-21取代AP 链,然后通过第二个TMSDR,使亚甲基蓝(MB)标记的DNA 燃料链取代目标miRNA-21和PP链.随后,释放的目标物miRNA-21可以参与下一次EDC进行循环重复反应.最后,大量的MB修饰的DNA 链被金电极捕获,产生显著放大的电流信号.这种生物传感器对miRNA-21 的检测限低至1.4 f M,并显示出良好的选择性.该方法还可以用于检测癌细胞中miRNA-21 的表达水平,在生物标志物miRNA 的灵敏检测以及癌症早期诊断方面具有巨大潜力.

图4 基于EDC的miRNA 电化学检测方法[7]

杂交链式反应(HCR)是一种自组装信号放大技术,在常温下即可发生反应,操作简单,实验成本低.HCR 打破了以往核酸扩增方法的固有印象,摒弃了复杂的热循环步骤,实现了类似PCR 的超高检测灵敏度,且无需酶的参与,大大简化了检测方法[8].HCR最早是于2004年由Pierce和Dirks提出的[9].如图5所示,HCR 是由两个发卡DNA(H1和H2)组成,在目标物I的存在下,通过TMSDR 依次打开两个发卡DNA 形成长的双链DNA 纳米线.H1的茎端含有与目标DNA I的区域b*互补的区域b,连接在序列b的单链区域a与目标DNA 的区域a*互补,发卡H1的环端由序列c组成.另一个发卡H2由茎端双链b/b*、相应的环部区域a*和与H1的环端区域c互补的单链区域c*组成.存在分析物I时,区域a和b通过TMSDR 打开了发卡H1并产生了一个稳定性增强的DNA 双链I-H1.在I-H1结构中,单链区域c-b*打开发卡H2,同时产生结构I-H1·H2,露出的单链区域a*-b*与目标物序列相同,可继续打开发卡H1,进行循环杂交反应.目标物DNA 引发了一个恒温自发的聚合过程,即交叉打开发卡H1和H2,最终形成一个由I-(H1·H2)n组成的长聚合的纳米线.

图5 HCR 原理图[9]

Wu等开发了一种基于HCR 的超灵敏信号放大策略,并探究了其在活细胞中m RNA 成像方面的潜力[10].如图6所示,设计了两个发卡结构的DNA 探针H1和H2,H1上标记了荧光供体羧基荧光素(FAM),H2上标记了荧光受体四甲基罗丹明(TMR).通过静电作用使H1和H2探针稳定地组装在肽包被的金纳米粒子上.由于核心的金纳米粒子能够有效淬灭FAM 和TMR 荧光,使H1和H2上的荧光信号非常微弱.细胞内的m RNA 靶标与H1杂交,并在H1中产生单链,这可能会使H1在粒子上解离或增加迁移率,促进其与H2杂交,并释放与目标序列相同的单链.通过H1和H2之间的交替杂交反应,产生由多个H1和H2组成的长的双链DNA 纳米线.HCR 产物具有刚性双链构象,降低了对纳米组装体的亲和力,使其从金纳米粒子的表面解离下来,荧光供体和受体的距离拉近,以激活指示目标m RNA表达的荧光共振能量转移(FRET)信号.该纳米传感器的检测限为0.5 pM,具有高灵敏分析的潜力.这种DNA 纳米组装体具有独特的阳离子夹层和金核的结构,有利于核酸探针对细胞的高效递送和荧光猝灭,从而实现了细胞内m RNA 的灵敏成像.

图6 基于HCR 的金纳米粒子用于miRNA 成像原理[10]

为了提高单级HCR 的灵敏度,Wei等构建了串联HCR 反应进行信号放大[11].上游HCR-1的扩增产物作为下游HCR-2的触发器,产生多个分支的双链DNA 共聚纳米结构.如图7 所示,引发链触发HCR-1中两个DNA 发卡的交叉打开,生成HCR-1纳米线,该纳米线含有下游HCR-2的触发链(T).T引发了HCR-2的发卡反应物的多重组装,产生树状分枝的DNA 纳米结构.并且通过将两个荧光团的距离拉近,将分析物的识别过程转换为放大的FRET信号.通过引入辅助DNA,串联HCR 反应可以简便地应用于其他分析物的灵敏检测.这种扩增方案可以用于高灵敏度和选择性检测缓冲液和人的血清中低至3 pM 的miR-21.串联HCR 反应进一步实现了高效、准确的细胞内miRNA 成像,并且可以通过miRNA 的含量不同从而区分不同的肿瘤细胞,为潜在的生物医学应用提供了强大的多功能工具.

图7 级联HCR 反应用于miRNA 成像原理[11]

除了发卡介导的多支状HCR,Chen等报道了一种无发卡介导的多支状HCR,用于miRNA 的电化学检测[12].如图8所示,将Y 形DNA 结构(由3条单链DNA Y1、Y2 和Y3 组成)作为探针固定在电极上,miRNA 作为靶标竞争探针结合位点,从Y 形结构中释放出Y3,进而触发电极表面的非线性HCR反应.这种竞争性结合方法显著提高了该生物传感器的特异性.非线性HCR 进一步实现了电化学信号的扩增,在1～10000 f M 的浓度范围内对miRNA-25呈线性响应,检测限为0.333 4 f M.该生物传感器能够有效区分单碱基突变和其他miRNAs,在miRNA 检测方面具有较高的特异性.

图8 HCR用于基于多支状HCR的miRNA的电化学检测原理[12]

催化发卡自组装反应(CHA)最早是于2008 年由Pierce等[13]提出的.如图9所示[14],目标物C1作为立足点打开H1并形成C1-H1中间体,同时释放出H1上的结构域3*,3*可以与H2的结构域3结合,再次启动链置换反应以形成H1-H2-C1复合物,这种不稳定的复合物进一步解离为C1和H1-H2,解离下来的C1可以引发新一轮CHA 反应,生成大量的双链DNA 产物H1-H2.

图9 CHA 原理图[14]

由于CHA 反应具有快速且高效的扩增性能,因此该技术已经被广泛应用于核酸、蛋白质和小分子检测以及活细胞成像等.例如,Wu等设计了一种基于CHA 的m RNA 成像方法[15],如图10 所示.细胞内的目标m RNA 打开发卡H1,产生H1-m RNA 中间体.H1-mRNA 中间体释放的结构域3*进一步打开H2,随后打开的H2将目标m RNA 取代下来,使目标m RNA 继续催化下一轮杂交反应,生成双链DNA 产物,产物将标记了猝灭基团的序列从双链上取代下来,使荧光基团的荧光恢复,在细胞内产生了扩增的荧光信号,从而实现了细胞内m RNA 的成像.

图10 基于CHA 的细胞内m RNA 成像原理[15]

为了提高CHA 的灵敏度,近年来研究者们将CHA 和其他的扩增策略相结合以提高检测方法的信号扩增能力.Wang等设计了一种级联CHA-HCR 反应,用于信号扩增及细胞内的miRNA 成像[16].如图11所示,该CHA-HCR 反应包含两种信号扩增方法:上游CHA 和下游HCR.目标物I引发上游CHA 反应,通过链置换反应打开H1以生成I-H1,I-H1释放的单链序列打开发卡H2,进而置换出目标物进行下一轮催化杂交反应,并产生大量的双链DNA 产物,产物暴露出的T 作为下游HCR 的引发链,引发下游发卡H3、H4、H5和H6的HCR 自组装,最终生成大量的双链DNA 纳米线,同时拉进FAM 与TAMRA的距离从而产生显著的FRET 信号.该反应的检测限为2 pM,级联的CHA-HCR 反应被进一步应用于活细胞内miRNA-21的精确成像,通过检测miRNA的含量可以区分不同肿瘤细胞.

图11 级联CHA-HCR 反应用于miRNA 检测原理[16]

为了进一步提高CHA 的灵敏度,还可以构建具有更高扩增能力的自催化反应.自催化是指将整体化学反应的产物用作其至少一个子系统或整个系统本身的催化剂的现象.例如Dai等设计了一种自催化的CHA 反应用于DNA 和ATP 的比色检测[17].如图12所示,这个自催化发卡组装(SRCHA)反应由发卡H1和H2组成,分别含有部分引发链序列和G-四链体序列.

图12 自催化的CHA反应用于DNA和ATP 的比色检测原理[17]

在ATP或者引发链的存在下,H1的发卡结构打开(Step 1),H1新暴露的粘性末端与H2的粘性末端杂交形成中间引发链-H1-H2(Step 2);然后,引发链被释放(Step 3),它可以作为新的催化剂来继续引发CHA 反应,同时生成H1-H2复合物(循环I),复合物使两个引发链片段距离接近,形成完整的引发链复制品,促使H1-H2继续打开H1形成H1-H2-H1复合物,触发第二次循环(Step 4～6)形成更多的H1-H2复合物.复合物使两个G-四链体片段距离接近以形成完整的G-四链体结构,随后与氯化血红素相互作用,形成具有类辣根过氧化物酶(HRP)催化活性的氯化血红素/G-四链体脱氧核糖核酸酶(DNAzyme),并催化H2O2介导的ABTS2-氧化,生成有色的ABTS·-,产生比色信号.在SRCHA 反应中循环使用引发链及其复制品产生大量复合物,同时产生了自催化的信号扩增.该方法的检测限约为48 n M,这种基于SRCHA 的ATP 检测方法与先前报道的ATP检测方法有相似的灵敏度,但其检测时间明显更短.

核酸酶是一种具有催化性能的单链核酸,通过SELEX 体外筛选得到,已被证明可以催化DNA/RNA 的剪切、连接等反应[18],以及催化氧化还原反应.生物传感器中最常用的DNAzyme是具有剪切活性或者类辣根过氧化物酶催化活性的DNAzyme,下面分别介绍基于这两类DNAzyme的生物传感器.

4.1 具有剪切活性的核酸酶

DNAzyme通常需要辅因子来催化DNA 或RNA的剪切,是一种很有前景的信号放大器.目前已知的辅因子有金属离子(Pb2+[19]、Mg2+[20]、Zn2+[21]、Cu2+[22]、Ni2+[23]、Hg2+[24])、组氨酸[25]等.最常用的以金属离子作为辅因子,催化切割RNA 的DNAzyme是8～17 DNAzyme[26]和10～23 DNAzyme[27].如图13所示,DNAzyme(蓝色链)可通过Watson-Crick碱基配对杂交与含有核糖腺嘌呤(r A,黄色)的DNA 底物(紫色链)特异性结合[28].在辅因子的存在下,DNAzyme可折叠成具有催化活性的结构,在“r A”位点对底物进行切割,从而释放切割底物的两个片段.

图13 DNAzyme剪切原理图[28]

DNAzyme可以与其他核酸扩增反应组装,以产生更高的检测灵敏度.Wang等设计了一种恒温无蛋白酶的CHA-HCR-DNAzyme级联反应,用于miRNA 的检测以及细胞内成像[29].如图14所示,目标物I引发H1和H2的CHA 反应,形成中间产物H1-H2,中间产物暴露出HCR 的引发链T,进一步引发下游发夹H3、H4、H5和H6的HCR 反应,从而得到了含有大量DNAzyme的纳米线.然后在Mg2+辅因子的存在下,这些新组装的DNAzyme被激活以切割特定的含核糖核苷酸的底物,由DNAzyme裂解的底物使标记FAM 和猝灭剂的序列断开,产生显著增强的荧光信号.

图14 级联CHA-HCR-DNAzyme反应用于miRNA检测原理[29]

该CHA-HCR-DNAzyme级联反应通过顺序引发CHA、HCR 和DNAzyme,巧妙地实现了三重扩增效果以检测目标物,成功应用于高灵敏度和选择性的miRNA-21检测,检测限为2 pM.而且,该反应被进一步用于活细胞中miRNA-21 的精准成像,并显示出实时分析低表达、短链RNA 靶标的巨大潜力.

此外,DNAzyme可以分别与CHA 或HCR 组成自催化反应.例如Zou等开发了一种新的交叉催化的CHA-DNAzyme反应[30],如图15所示,该反应由两个催化反应组成:CHA反应由H1,带有荧光团供体和受体的H2,DNAzyme底物S-L组成.交叉催化反应从引发链T激活CHA 反应开始,使携带部分DNAzyme的H1和H2连续杂交,形成完整的DNAzyme结构.同时,H2的打开增大了荧光团供体和受体的距离,从而恢复供体的荧光信号.随后,DNAzyme特异性地切割底物S-L 复合物,并连续释放T 以反向引发CHA 反应.因此,DNAzyme将底物转化为CHA 的引发剂,从而显著促进CHA 的扩增,实现交叉催化的CHA-DNAzyme反应.该生物传感器的检测限为15.6 pM,这可以与许多其他无酶传感方法相媲美.级联的交叉催化扩增传感系统可以区分细胞内miRNA的不同表达水平,具有较高的检测灵敏度.

图15 交叉催化CHA-DNAzyme反应原理[30]

为了进一步提高检测的灵敏度,Jie等通过HCR和DNAzyme之间的协同交叉引发,开发了一种用于体外和体内microRNA 成像的DNA 自催化方法[31].如图16 所示,DNAzyme的两部分分别连接在发卡H1和H3上,阻止活性DNAzyme的形成,而荧光团给体和受体分别修饰在发卡H2和H4上,阻止它们发生FRET.底物(S)由含有核糖核苷酸(r A)的DNAzyme底物a*-h*和启动序列(T)组成,与阻断链(L)部分杂交以阻止S上的T 直接引发HCR.引发链T 触发HCR 反应物的循环交叉打开,产生DNAzyme纳米线,并使两个荧光团(FAM 和TAMRA)靠近,从而实现荧光共振能量转移(FRET).随后,每个DNAzyme在Mg2+的存在下可以催化剪切底物(S/L)以释放T 触发HCR 反应发生.HCR 纳米线中的每一个DNAzyme都会产生大量的HCR 触发器,以加速整个相互催化反应过程.该反应表现出HCR 和DNAzyme相互催化的NN 倍的指数扩增效率,产生大量长的串联DNAzyme纳米线和显著增强的FRET 信号.对microRNA 的检测限达到6.8 pM,这与大多数其他无蛋白酶的信号扩增方法相当,甚至更低.该生物传感器实现了细胞和活体内的miRNA检测,从而为体内追踪少量生物标志物提供了一个强大的传感平台.

图16 交叉催化HCR-DNAzyme反应原理[31]

4.2 具有类辣根过氧化物酶催化活性的核酸酶

除了具有剪切活性的核酸酶,还具有类辣根过氧化物酶催化活性的DNAzyme,即氯化血红素/G-四链体DNAzyme,其催化活性比单纯的氯化血红素增强上百倍,被广泛应用于比色和化学发光检测.例如,Shimron等通过将氯化血红素/G-四链体DNAzyme与HCR 相结合,用于检测目标DNA[32].如图17所示,它由两个发卡结构1和2组成.发卡1的5＇端含有3/4的G-四链体序列,发卡2的3＇端包含1/4的G-四链体序列.目标物引发HCR 反应,生成长的含有多个DNAzyme单元的纳米线,在H2O2存在的条件下,氯化血红素/G-四链体纳米线催化ABTS2-氧化为ABTS·-(λmax=420 nm),产生比色信号,或者催化氧化鲁米诺,产生化学发光信号(λmax=415 nm).该平台对分析物DNA 的检测限可以达到1×10-13M,证明了基于DNAzyme的系统的高选择性.

图17 氯化血红素/G-四链体与DNAzyme纳米线的无酶自主组装放大用于检测级联HCR-DNAzyme反应原理[32]

鲁米诺的发射波长较短,其穿透能力有限,为了使输出信号的发射波长更长,可以通过引入化学发光共振能量转移(CRET)信号转换方式来增强信号.化学发光共振能量转移是将化学反应产生的供体分子激发态能量转移到受体分子的能量转移过程.化学发光供体不需要外部激发光源,没有自发荧光和光漂白的干扰,因此在分析检测等众多领域表现出优异的性能.例如,Zhang等将封装染料的金属有机框架纳米粒子UiO-66与HCR-DNAzyme结合,对miRNA 进行基于CRET 的放大检测[33].如图18所示,将一个反应物发卡修饰到封装染料的UiO-66 上,目标物miRNA 将UiO-66上的发卡结构打开,产物继续打开溶液中的另一个发卡,通过发生HCR,在UiO-66上形成长的含有重复DNAzyme单元的纳米线.在鲁米诺和H2O2的存在下,氯化血红素/G-四链体DNAzyme催化鲁米诺的氧化反应,通过化学发光共振能量转移将能量转移给UiO-66中负载的染料,使染料在没有外部光源激发的情况下产生发光信号,实现对miRNA 的灵敏检测.

图18 基于HCR-DNAzyme的金属有机框架化合物用于CRET 介导的miRNA 检测原理[33]

该系统对miRNA-21进行分析的检测限为1.67 n M,对miRNA-155的检测限为0.17 n M.此外,通过改变识别发卡和封装不同的染料,该体系还可以用于检测p53和BRCA1.

本文总结了一些基于恒温无蛋白酶的核酸扩增反应的生物传感器,见表1.包括基于熵驱动反应(EDC)、杂交链式反应(HCR)、催化发卡自组装反应(CHA)以及具有剪切活性或类辣根过氧化物酶催化活性的核酸酶的生物传感器,同时也总结了一系列基于级联和自催化扩增反应的生物传感器,产生更强的信号扩增能力.它们在荧光、比色、电化学、化学发光检测等方面都显示出了简便、高效、高灵敏度等特点和优势,被广泛应用于DNA、RNA、细胞、蛋白质、小分子和金属离子等目标物的检测.尽管恒温无蛋白酶的核酸检测方法已经取得了一些进展,但这些检测方法也存在一定的局限性,例如,目前没有具体的CHA 和HCR 设计方法,大部分设计只能参照已有文献中的发卡结构进行调整;DNAzyme底物链中的r A 在复杂环境中有解离的可能性;基于DNAzyme的化学发光和CRET 难以高效地将多种反应物运输到细胞,同时实现长时间的检测和成像.更重要的是,如何将所有反应物限域到一定的空间或者载体上,实现生命体系中高效的限域扩增,以及发卡反应物的稳定性和生物安全性问题等仍是目前面临的巨大挑战,需进一步的完善和发展相关检测体系.

表1 常见的恒温无蛋白酶的核酸扩增反应

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