汪燕，杨玉，胡玲榕，陈春林

(宜春学院化学与生物工程学院，宜春 336000)

近年来，精神类疾病发病率日益增长，抑郁症患者人数逐年上升，患者的发病和自杀也出现低龄化趋势[1]。采取安全、有效的方法缓解症状、改善患者生命质量一直是研究热点。氯胺酮(ketamine，Ket)是一种N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受体拮抗剂，能刺激脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)释放，激活海马组织中雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的表达，发挥快速抗抑郁作用[2-3]。但Ket抗抑郁作用剂量与产生类似精神分裂症状剂量相当，且维持抗抑郁功效常需反复给药，易导致药物滥用，造成记忆缺陷[4]。丁基苯酞(n-butylphthalide，NBP)是从芹菜籽中提取的一种有效成分，能够改善脑细胞能量代谢，保护脑神经，常用于治疗急性缺血性脑卒中[5]。研究表明，NBP可调节AKT/CREB信号通路，改善能量代谢[6]，且联合用药治疗脑卒中后抑郁具有较好疗效[7]。为了减少Ket用药剂量，降低其不良反应，笔者在本实验尝试通过建立体内、外急性抑郁模型，探究小剂量Ket联合NBP抗抑郁效果，并采用蛋白免疫印迹法检测细胞外信息调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、BDNF等相关蛋白表达量的变化，考察联合用药的作用机制。

1.1材料

1.1.1细胞系 大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(pheo-chromocytoma cell，PC12)购于上海泰然生物科技有限公司。置于10%牛血清(fetal bovine serum，FBS)、青霉素和链霉素配置成的达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco"s modified Eagle"s medium，DMEM)中，在37 ℃、5%二氧化碳(CO2)孵箱中培养。

1.1.2动物 选用清洁级雄性的ICR小鼠，鼠龄6～8周，体质量(22±2) g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(湘)2019-0004。随机分笼饲养，每笼10只。室温( 23±2) ℃，相对湿度 50%～65%。光照遵循自然规律，自由饮水、进食。

1.1.3试剂 NBP(中国食品药品检定研究院，批号：201602，含量：99%)，Ket(福建古田药业有限公司，批号：1709291)，皮质酮(CORT)(阿拉丁生物科技有限公司，批号：11530027，含量：98%)，CCK-8(桥生物有限公司，批号：BRI141105)，Anti-BDNF Rabbit p Ab、Synapsin(成都正能生物技术有限责任公司，批号分别为：20200611，2020108)，P44/42 MAPK(Erk1/2)、p-P44/42 MAPK(Erk1/2)、β-actin(美国 Cell Signaling Technology公司，货号分别为：21，30，1)。山羊抗鼠二抗(美国Jackson ImmunoResearch公司)。

1.1.4仪器 Imark 酶标仪、Trans-Blot1703930 蛋白电泳仪，均购于美国Bio-Rad公司；
Nikon ECLIPSE Ti2-U荧光倒置显微镜。

1.2分组给药及抑郁模型的建立

1.2.1细胞分组给药及建立CORT模型 参照文献[8]。取对数生长的PC12细胞分成6组：空白对照组(细胞培养液)、模型对照组(CORT 400 μmol·L-1)、对照A组(CORT 400 μmol·L-1+NBP 1 μmol·L-1)、对照B组(CORT 400 μmol·L-1+Ket 0.01 μmol·L-1)、阳性对照组(CORT 400 μmol·L-1+Ket 0.1 μmol·L-1)、联合组(CORT 400 μmol·L-1+Ket 0.01 μmol·L-1+NBP 1 μmol·L-1)。接种于96孔板中，待细胞贴壁，给予不同浓度(100，200，300，400，500 μmol·L-1)CORT溶液100 μL，继续培养24 h。

1.2.2小鼠分组给药及急性造模 参照文献[9]。将40只小鼠按照体质量随机分为4组：模型对照组、NBP 组(30 mg·kg-1NBP[10])、Ket组(1 mg·kg-1Ket[11])、联合组(30 mg·kg-1NBP+1 mg·kg-1Ket )，随机分组具体方法：将小鼠称质量并标记，按质量大小分区，再将各区组小鼠随机平均分配到各组[11]。NBP采用油溶，灌胃给药，Ket用0.9%氯化钠溶液溶解，腹腔注射给药。模型对照组给予等量食用油和0.9%氯化钠溶液。

1.3细胞实验观察指标

1.3.1CCK-8法检测细胞活力 细胞培养24 h后，每孔加入10 μmol·L-1CCK-8继续培养1～4 h，用酶标仪在波长450 nm处测定其吸光度(A值)，细胞存活率(%)=(A值实验组-A值调零组)/(A值对照组-A值调零组)×100%。

1.3.2细胞突触形态观察 将细胞接种于6孔板中继续培养，于倒置显微镜(×20)下观察细胞突触生长形态并拍照。随机取5个视野，选择轴突大于胞体的细胞，测量轴突长度，取其平均值。

1.3.3细胞蛋白的收集 以每皿2×107个细胞接种到100 mm培养皿中，按照上述实验步骤进行给药，弃培养液，用预冷的 0.01 mol·L-1磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，加入细胞裂解液，冰上裂解30 min后收集蛋白，离心10 min(12 000×g，4 ℃)，取上清液于-80 ℃保存。

1.3.4Western blotting实验检测synapsin蛋白表达 采用 Bradford法进行蛋白定量，BSA检测蛋白浓度，稀释成统一浓度后置于100 ℃沸水中煮5 min。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)电泳，将蛋白经湿转缓冲液转至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，在5%脱脂奶粉的 TBST 溶液中封闭1～1.5 h，一抗4 ℃孵育过夜，TBST 洗涤3次，二抗孵育1 h，TBST洗涤3次，取出滴加适量显影液，用Alpha Fluor Chem 凝胶成像仪检测。

1.4小鼠行为学检测

1.4.1强迫游泳实验测定不动时间 强迫游泳(forced swim experiment，FST)实验建立急性抑郁模型。FST装置由内径为14 cm，高20 cm，水深15 cm烧杯组成，水温(23±2 )℃[13]。实验前24 h预游泳15 min。给药30 min后，将小鼠置于烧杯中6 min，观察后4 min累计不动时间(s)。

1.4.2旷场实验测定水平爬格数和直立次数 旷场由四周均为黑色，且长、宽、高均为 50 cm敞箱构成[14]，实验前将小鼠置于实验环境中适应1～2 h。给药30 min后置于敞箱中间。记录小鼠在5 min内的水平爬格数与直立次数。每只小鼠记录完成后需用乙醇擦拭，防止留下气味对实验造成干扰。

2.1CORT对PC12细胞存活率的影响 细胞存活率随CORT浓度增大逐渐降低，见表1，当CORT浓度为400 μmol·L-1时，细胞活性损伤相对稳定，且均能导致约半数细胞死亡，可用于建立细胞损伤体外抑郁模型。

表1 不同浓度皮质酮对PC12细胞存活率的影响

浓度/(μmol·L-1)细胞存活率/%0100.00±0.0010084.82±8.63①20070.27±1.45①30060.74±1.92①40053.63±2.25①50052.66±1.77①

2.2PC12细胞存活率 与模型对照组比较，对照A组、对照B组对细胞存活率无明显作用，差异无统计学意义(均P>0.05)，两者联用能够显著改善细胞存活率，且差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2 不同给药方式对CORT诱导的PC12细胞损伤作用的影响

2.3PC12细胞神经元损伤情况 各组细胞形态见图1。与模型对照组比较，对照A组、对照B组对细胞神经元均无明显作用，两者比较差异无统计学意义(P>0.05)，两者联用逆转细胞神经元损伤，差异有统计学意义(P<0.01)，见表3。

2.4PC12损伤细胞蛋白表达

2.4.1PC12损伤细胞p-ERK/ERK表达 与对照组比较，模型对照组损伤细胞p-ERK/ERK的表达明显下调。与模型对照组比较，对照A组、对照B组单药组对p-ERK/ERK表达均无明显作用(P>0.05)，两者联用能够提高p-ERK/ERK蛋白表达，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

2.4.2PC12损伤细胞BDNF蛋白的表达 与对照组比较，模型对照组损伤细胞BDNF的表达明显下调。与模型对照组比较，对照A组、对照B组单药组对BDNF表达均无明显作用，两者联用能够抑制BDNF蛋白表达的减少，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

2.4.3PC12损伤细胞synapsin蛋白的表达 与对照组比较，模型对照组损伤细胞synapsin的表达明显下调。与模型对照组比较，对照A组、对照B组单药组对synapsin表达均无明显作用，两者联用能够缓解synapsin蛋白的下调，但差异无统计学意义(P>0.05)，见图4。

A.空白对照组；
B.模型对照组；
C.对照A组；
D.对照B组；
E.阳性对照组；
F.联合组

表3 不同给药方法对CORT诱导的PC12细胞损伤神经元突触长度的影响

2.5小鼠行为学变化 ①对小鼠FST累计不动时间的影响：与模型对照组比较，NBP 组、Ket组单剂量给药缓解小鼠在FST中的累计不动时间，但差异无统计学意义(P>0.05)，两者联用降低小鼠在FST中累计不动时间疗效显著，差异有统计学意义(P<0.01)，见表4。②对小鼠水平爬格次数和直立次数的影响：各组之间小鼠水平爬格数与直立次数差异无统计学意义(均P>0.05)，见表4，说明急性给药后对于小鼠自主活动能力无显著影响。

PC12细胞来源大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤，广泛用于神经系统疾病的体外研究[15]。CORT 作为一种肾上腺皮质激素，经实验检测，慢性应激诱导的抑郁大鼠体内CORT水平升高，BDNF合成障碍[16]。本实验以CORT诱导PC12细胞损伤建立体外抑郁模型，结果发现，当CORT浓度为400 μmol· L-1时，细胞损伤均约为50%，可产生神经毒性，用于后续造模。FST是经典的评价抗抑郁药效的急性应激造模方法，小鼠累计不动时间常作为评价抑郁症行为的指标[17]。本项研究尝试通过体内外实验探讨NBP对小剂量Ket抗抑郁作用及机制的影响，结果证明NBP(1 μmol· L-1)联合小剂量Ket(0.01 μmol·L-1)能够显著改善CORT诱导PC12细胞损伤的存活率，促进神经元增长，显著降低小鼠在FST累计不动时间，提高小剂量Ket的抗抑郁活性。

A.空白对照组；
B.模型对照组；
C.对照A组；
D.对照B组；
E.阳性对照组；
F.联合组；
①与空白对照组比较，t=10.011，P<0.05；
②与模型对照组比较，t=-2.368，-2.298，P<0.05。

A.空白对照组；
B.模型对照组；
C.对照A组；
D.对照B组；
E.阳性对照组；
F.联合组；
①与空白对照组比较，t=6.576，P<0.05；
②与模型对照组比较，t=-3.709，-1.713，P<0.05。

BDNF是中枢神经重要的神经营养因子，能够调节机体情绪和认知功能[18]。研究表明，BDNF及其他神经营养因子缺乏导致的神经损伤是抑郁症发病的病理基础[19]。因此，调节中枢神经BDNF水平常作为抗抑郁活性指标[20]。ERK是BDNF上游的信号通路，可通过调节cAMP反应元件结合蛋白(CAMP-response element binding protein，CREB)的磷酸化，影响BDNF水平[21]。因Ket能够刺激BDNF的释放，激活mTOR的表达，且NBP能够调节AKT/CREB信号通路。由此可推测NBP与Ket的抗抑郁作用均可通过ERK-BDNF通路产生协同作用。本实验为探究联合作用机制，经Western blotting法检测NBP对小剂量Ket在PC12损伤细胞中p-ERK/ERK、BDNF和synapsin蛋白表达的影响。结果证实，NBP联合小剂量Ket能够促进CORT诱导损伤细胞中p-ERK/ERK、BDNF、synapsin蛋白的表达。

综上所述，NBP能够提高小剂量Ket的抗抑郁活性，探究作用机制可能与ERK-BDNF信号通路相关。本次实验虽从体内外考察NBP对小剂量Ket抗抑郁作用及机制的影响，但实验仍存在不足，后续实验应采取相关蛋白质抑制剂验证其作用机制。

A.空白对照组；
B.模型对照组；
C.对照A组；
D.对照B组；
E.阳性对照组；
F.联合组；
①与空白对照组比较，t=7.543，P<0.05。

表4 4组小鼠累计不动时间

分组剂量/(mg·kg-1·d-1)FST/s水平爬格次数直立次数模型对照组-177.6±17.33192.00±44.0356.88±12.17NBP组30145.40±17.50183.40±33.6369.00±15.59Ket组1147.90±31.70185.10±56.2866.50±13.97联合组30+1119.90±41.45①161.50±39.1772.50±21.97

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