王 晶，李 建，史根生，郝华正，冀中锐，邢国明

(1. 山西农业大学经济作物研究所，汾阳 032200；
2. 山西农业大学园艺学院，太谷 030801)

石 竹 属（DianthusL. ） 为 石 竹 科（Caryophyllaceae）一、二年生或多年生草本。石竹属植物遗传多样性丰富，全球共约600 余种，中国有近20 种石竹属植物，多分布于北方草原和山区草地[1-2]。石竹属花卉植物花色艳丽、花期长，具有较高的观赏价值，同时具有较强的耐旱、耐寒和耐热性，是极为宝贵的基因资源[3]。香石竹（Dianthus caryophyllusL.）是世界四大切花之一，在花卉市场中占有重要地位[4-6]；
常夏石竹（Dianthus plumariusL.）繁殖能力强，生长迅速，可有效防止土壤冲刷和水土流失，是重要的绿化环保植物；
石竹（Dianthus chinensisL.）花色繁多，且根和全草入药清热利尿、散淤消肿，具有宝贵的药用价值和观赏价值；
瞿麦（Dianthus superbusL.）也可全草入药，有清热利尿、破血通经功效，同时也可做农药，能杀虫[7-10]；
须苞石竹（Dianthus barbatusL.）色彩艳丽、芬芳馥郁，是切花的重要来源，同时也可吸收二氧化硫和氯气等有害气体，净化空气，是重要的绿化植物[11]。

通过种间杂交聚合各物种的优异性状是石竹属花卉常用的育种策略，石竹属种间亲缘关系直接影响种间杂交效果[12-13]。分子标记作为强有力的生物学研究工具，被广泛应用于植物品种鉴定与保护、品种选育、分子机理研究等方面[14-17]，它可有效地鉴定出植物的亲缘关系，从而使育种工作者更好地制定出杂交育种计划[18-20]。常用的分子标记有3 代，一代的RFLP、AFLP、SRAP 等标记，二代的SSR和InDel 标记，三代的SNP 标记。SNP 标记作为最新的标记，基因组分布密度高，易于高通量分型检测，备受基因定位等研究工作者青睐，但其单标记多态信息较低，用于遗传背景分析上略有不足；
SSR标记多态信息较高，但等位基因型间的差异较小，给分析带来不便；
InDel 标记虽然在等位基因型间差异大，但基因组密度较低，也不利于做遗传背景分析。SRAP 标记既有较高多态信息，又易于区分差异，同时基因组密度适中，适合用于遗传背景分析。

目前，有关石竹属植物的亲缘关系分子研究较少，已有报道仅在新疆等部分地区和部分栽培品种上，有关山西地区及野生材料的背景研究更为罕见。本研究利用SRAP标记对采自中国山西省14个地区的13 份野生石竹种质和7 份野生瞿麦种质以及24份常见的香石竹、常夏石竹和须苞石竹品种进行了种间和种内的遗传多样性分析，以期为石竹属花卉品种保护与鉴定、杂交育种及分子机理研究提供一定的理论基础和技术支撑。

1.1 种植资源收集

石竹属供试材料共44 份，包含13 份野生石竹种质和7 份野生瞿麦种质以及24 份常见的香石竹、常夏石竹和须苞石竹品种。在山西省从南到北选择15 个采样点，详见表1 和表2，从市场收集了24个常见的香石竹、常夏石竹和须苞石竹品种（表2）。

表1 野生石竹和野生瞿麦采集点地理信息Table 1 The geographic information about the collected D. chinensis and D. superbus

表2 参试样本信息Table 2 Information of samples

1.2 试验方法

用CTAB 法提取石竹基因组DNA，通过浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳进行DNA 纯度及完整性检测。提取后的DNA 溶于1×TE buffer，并保存在-20 ℃冰箱中备用。PCR 反应体系为20 μL，其中各成分浓度及体积分别为2×PCR Mix 为10 μL，引物（25 μmol·L-1）为2 μL，DNA（20 ng·μL-1）为2 μL，ddH2O为6 μL。PCR 反应程序包含5 个步骤：①预变性步骤：94 ℃变性5 min（1 个循环）；
②预扩增步骤：94 ℃变性1 min，35 ℃退火1 min，72℃延伸80 s（共5 个循环）；
③延伸步骤：72 ℃延伸10 min；
④再次扩增步骤：94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸80 s（共37 个循环）；
⑤再次延伸步骤：72 ℃延伸12 min。PCR 反应结束后，利用6%的PAGE 凝胶电泳对产物进行带型检测，并通过银染拍照保存。PCR Mix 反应试剂采购于康为世纪生物科技有限公司，引物由本实验室自主开发[21]，序列见表3, 引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。

表3 SRAP 引物序列[21]Table 3 Sequences of SRAP primers

通过对银染后的照片进行产物的带型统计，SRAP 标记为显性标记。为方便记录和分析，将各标记的基因型的有无记录为A 和B，生成44 份样本的指纹图谱，遗传距离使用软件NTSYSpc-2.0 进行计算。

2.1 DNA 提取与PCR 产物检测

经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，采用CTAB 法提取的石竹材料DNA 带型清晰、无拖尾，同时亮度非常高，表明本试验所用DNA 浓度高、完整性好，满足后续PCR 实验要求（图1a）。使用上述DNA对88 对SRAP 引物进行扩增效果鉴定，最终筛选出20 对引物扩增产物条带清晰、特异性高，可用于后续指纹图谱分析（表4 和图1b）。

表4 20 对SRAP 引物扩增产物多态性信息统计Table 4 Polymorphism information statistics of 20 pairs of SRAP primers’ amplification products

2.2 指纹图谱分析

经统计，上述20 对特异性引物扩增出了518 个条带，平均条带数为每对25.9 条，平均多态性条带为每对20.7 条，多态性比率均值为78.9%，分辨力为35.6%～100%。其中，引物组合Me-8/EM-3 的多态性最高，可区分全部44 份石竹样品（表4）。根据统计结果，将引物组Me-8/EM-3 基因型的有无转化为字母A 和B，形成每个样本的指纹图谱（表5）。

表5 ME-8/EM-3 建立的44 个样品的指纹图谱Table 5 Fingerprints of 44 salvia varieties established by the primer group of ME-8/EM-3

2.3 遗传多样性分析

根据SRAP 引物扩增的414 条多态性条带，对44 个样品进行遗传多样性分析。

Jaccardp’s 相似系数在0.73 ～ 0.98 之间。在相似系数0.79 的水平上，可以将材料分为5 个类群：第1 个类群为五彩石竹的7 个品系和须苞石竹的2 个样品；
第2 类群为野生石竹的13 个样品；
第3 类群为野生瞿麦的7 个样品；
第4 类群为香石竹的7 个样品；
第5 类群为常夏石竹的8 个样品（图2）。由聚类结果可知，物种差异是石竹属植物类群划分的主要因素。五大类群中，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的亲缘关系比较近，与Ⅴ的亲缘关系比较远。从形态特征观察，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的茎均为疏丛生，而Ⅴ的茎为密丛生；
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ中，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ之间的亲缘关系又较Ⅳ为近，从株型特征观察，Ⅳ的植株较高，而Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的植株较矮；
Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ中，Ⅱ、Ⅲ之间的亲缘又较Ⅰ为近，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在形态学上相似，但Ⅱ、Ⅲ为野生石竹和野生瞿麦，而Ⅰ为园艺开发程度较高的栽培品种（图2）。

Ⅰ类群均为五彩石竹和须苞石竹。根据聚类结果分析，这一类群的聚类是根据种类和花色来划分的。其中，五彩石竹为第一类群，须苞石竹为第二类群。第一类群中白粉双色、淡粉色、粉色白边和玫粉色等4 个五彩石竹为一小类群；
白色、红色和红色粉边等3 个五彩石竹为一小类群。初步分析认为：白色和红色均为纯色而粉色是调和色，所以白色和红色聚为一类，粉色聚为一类。在粉色类型中，花色较淡的白粉双色和淡粉色五彩石竹的亲缘关系比较近，花色较深的粉色白边和玫粉色五彩石竹的亲缘关系比较近。

Ⅱ类群为野生石竹。根据聚类结果分析，这一类群的聚类是根据地域分布来划分的（图3）。其中霍州市七里峪、太谷县窑子头和沁水县历山的野生石竹聚为第一小类群，原平市云中山、平鲁区打草坪、大同市红石崖、浑源县恒山和天镇县黑龙寺的野生石竹聚为第二小类群，岚县黑茶山、交城县庞泉沟、方山县北武当山、宁武县大石洞和五台县五台山的野生石竹聚为第三小类群。第一小类群分布于山西省中南部，纬度较低；
第二小类群分布于山西省北部，纬度较高；
第三小类群分布于山西省中部。第一、二小类群之间的亲缘关系比较近，与第三小类群的亲缘关系比较远。初步分析认为：是由于一、二小类群分布在太行山区，而第三小类群分布在吕梁山区。

同样，Ⅲ类群为野生瞿麦。根据聚类结果分析，这一类群的聚类是根据地域分布来划分的（图3）。其中分布于山西南部的沁水县历山、芮城县百梯山、陵川县王莽岭的野生瞿麦为第一小类群，分布于山西中北部的庞泉沟、大石洞、云中山和五台山的野生瞿麦为第二小类群。

Ⅳ类群均为香石竹园艺品系。根据聚类结果分析，这一类群的聚类是根据品种类型划分的。其中紫色白边矮生康乃馨为第一类群，粉色康乃馨、桔黄色康乃馨、桔红色康乃馨、紫色康乃馨、红色康乃馨和白色紫边康乃馨等为第二类群。初步分析认为：紫色矮生康乃馨是山西长期栽培的矮生盆栽品种，而其他6 个均为云南生产的鲜切花品种。

Ⅴ类群均为常夏石竹。根据聚类结果分析，4-10-1、大唐贵妃、塞外昭君、常夏石竹、雪域西施、雪原1 号和月中嫦娥等7 个品种和品系为第一小类群，翡翠为第二小类群。初步分析认为：Ⅴ类群均为山西省农科院经济作物研究所从同一亲本选育的品种和品系，而翡翠石竹为该类型中的少花突变株系。

PCR技术的出现，打开了人们研究基因的天梯。分子标记具有不受环境和生长阶段影响、检测效率高、检测准确率高等优点，广受植物品种保护、品种选育以及分子机制研究人员的青睐。本研究从88对SRAP 引物筛选得到20 对高鉴别力的引物，并以此对44 份石竹样本进行基因型检测。根据遗传距离分析结果，该20 对引物组合可有效地区分44 份石竹属样本。因此，该20 对高鉴别力引物组合可以为石竹属植物品种保护与鉴定、育种应用提供可靠的标记基础。物种差异是石竹属植物划分的主要因素。生境条件是野生石竹和野生瞿麦种内类群划分的主要因素，育成品种的种内划分则主要依据花色与株型差异。石竹属植物遗传变异较高，同时具有高抗病性和高逆境适应性，是我国植物育种和品种改良的重要资源。

傅小鹏利用ISSR 和SRAP 标记分析了24 个石竹自交系的遗传多样性，系统分析了栽培的杂种优势和遗传背景关系[22]；
董连新则对新疆地区的野生和育成材料进行了遗传背景分析[2]。本研究开发了一套高鉴别力的SRAP 分子标记体系，并利用该套分子标记构建了44 份石竹属花卉种质的指纹图谱，对山西地区石竹属的主流育成品种和多点采集的野生材料进行了系统性的遗传背景分析。经遗传多样性分析发现，物种和生境差异是石竹属植物类群划分的主要因素，为石竹属植物种质资源鉴别与保护、品种选育以及分子机理研究提供了技术支撑和理论基础。

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