周亚秋，周红光,2*

1南京中医药大学第一临床医学院肿瘤研究所，南京 210046；
2南京中医药大学附属医院，南京 210009

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)认为是男性第三大常见癌症，女性第二大常见癌症，也是全球第二大癌症死亡原因。结直肠癌的发病率和死亡率正在迅速上升，尤其是在低收入和中等收入国家，据估计，到2030年，结直肠癌的全球负担将增加60%，超过220万新病例和110万癌症死亡[1]。传统的治疗方法有手术、药物、化疗等，但总体生存率并不理想。

中医药作为一种重要的抗肿瘤药物，已被临床研究证实。以往的研究表明，中医药结合化疗或放疗，可显著提高患者1～3年的生存率，减轻不良反应，改善生活质量，延长生存时间[2]，是治疗结直肠癌尤为重要的一种方法。古医籍中并无结直肠癌病名的确切记载，现多将其归为“锁肛痔”“肠风”“积聚”等范畴。《本草纲目》记载：“肠风下血，僵蚕炒去嘴足，乌梅肉焙各一两，为末，米糊丸梧子大。每服百丸，食前白汤下，一日三服。”其中僵蚕性平，味咸、辛，归肝、肺、胃经，祛风止惊、化痰散结；
乌梅性平，味酸、涩，归肝、脾、肺、大肠经，敛肺、涩肠、祛腐。两药分走阴阳，酸收辛散，遂组方取名为蚕梅方(Canmei Decoction，CMF)[3]。研究表明[4]，CMF提取物对AOM/DSS诱发小鼠腺瘤性肠息肉具有防治作用，能显著降低AOM/DSS小鼠腺瘤性息肉的发生率。

网络药理学是从系统、整体角度探索药物与机体相互作用的一门新学科[5]，为了探讨中药复方发挥药效的潜在活性成分和分子机制，该学科基于现代生物信息学研究方法，深层次解析了成分-成分、成分-靶点以及靶点-疾病网络之间的协同作用机制，反映了中药复方多成分、多靶点作用特点，体现了系统性和整体性的突出优势[6,7]。已有学者采用网络药理学方法探讨CMF抗结直肠腺瘤(colorectal adenoma，CRA)的潜在作用机制[4]，但尚没有采用网络药理学方法探讨CMF抗CRC作用机制的研究报道。本研究借助网络药理学研究方法，探讨其产生作用的信号通路，为CMF多成分、多靶点治疗的作用机制提供新思路。

1.1 筛选CMF的活性成分与靶标

一、通过化学成分数据库(http://www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp)、化学专业数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)及文献挖掘等方式，对僵蚕成分进行收集整理，建立僵蚕化学成分数据库。利用中药系统药理学数据库(TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)、Swiss Target Prediction数据库(http://www.Swisstargetprediction.ch/)筛选并获取候选活性成分。经ADME筛选后，依据可能性由大到小，选取Probability>0.1的成分蛋白作为靶点。二、利用TCMSP预测的乌梅全部成分靶点，设定药物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%且药物相似性(drug-likeness，DL)≥0.18为筛选条件。在Uniprot(http://www.uniprot.org/)数据库中剔除非人源及未经验证的靶点基因，建立所有靶标的基因信息库，将汇总的靶标名去重导入信息库进一步标准化。

1.2 筛选结直肠癌的靶点

利用人类孟德尔遗传数据库OMIM(https://omim.org/)、人类基因数据库GeneCards(https://www.genecards.org/)，以“colorectal cancer”为关键词，收集结直肠癌相关的人类疾病基因，根据score大于中位数对潜在靶点进行筛选，汇总后去除重复值，获得疾病靶点。

1.3 PPI数据采集与网络构建分析

在韦恩图绘制网站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)上传疾病和药物靶点，取交集获得核心靶点。再将上述核心靶点导入STRING数据库(https://string-db.org/)构建蛋白互作网络(protein-protein interaction，PPI)，筛选条件为score>0.7。借助CytoScape3.7.2软件及其内置工具计算此网络的拓扑参数，分析连接度(degree)、介度(betweenness)及紧密度(closenesss)数据得到起核心作用的靶点。

1.4 GO和KEGG富集分析

将核心靶点导入Metascape(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)行GO和KEGG富集分析。筛选前十个具有显著性差异的GO和KEGG数据予可视化处理。构建“基因-通路”网络以进一步诠释CMF治疗结直肠癌的关键靶基因。

1.5 CMF核心成分与关键靶基因的分子对接验证

在PubChem数据库寻找活性成分的SDF文件，利用PDB数据库(https://www.rcsb.org/)获取PPI网络中度值前6的靶点蛋白的蛋白结构。在PyMOL软件中对蛋白质结构去除水分子、加氢等处理，转换成PDBQT格式，然后在AutoDockTools1.5.6和Vina软件中完成分子对接，得到结合能(affinity)。利用PyMOL软件对结果进行可视化操作。

1.6 实验验证

1.6.1 实验细胞

人结肠癌细胞株HCT-116购自上海中乔新舟生物科技有限公司。细胞株用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，置于37℃、5%CO2，饱和湿度的培养箱中培养。

1.6.2 主要试剂

槲皮素(货号：H-009，HPLC纯度≥98%)购自瑞芬思公司；
Annexin V-FITC/PI试剂盒(KGA107)购自keygen公司；
SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(货号：G2003)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号：G2026)、超敏ECL化学发光试剂盒(货号：G2014)、蛋白Marker(货号：26617)、兔源Bax抗体(货号：GB11690)、HRP标记的羊抗兔IgG(货号：GB23303)、鼠源GAPDH抗体(货号：GB12002)均购自Servicebio公司；
鼠源Bcl-2抗体(AFFINITY公司，货号：BF9103)。

1.6.3 实验方法

1.6.3.1 MTT检测细胞活性

将对数生长期HCT116细胞以每孔1×104/mL个细胞接种于96孔板。待细胞贴壁后，每孔注入不同浓度槲皮素0、50、100、150和200 μmol/L培养液100 μL，每组设3个平行孔，培养48 h后，加入配制好的MTT(5 mg/mL)试剂20 μL/孔，在培养箱中继续孵育4h，吸去培养上清液后加入200 μL/孔DMSO，放置于摇床上低速避光振荡10 min，使结晶物充分溶解。用酶标仪测定490 nm处每孔的OD值。按如下公式计算细胞增殖抑制率。

细胞增殖抑制率=

(OD空白-OD实验)/OD空白×100%

式中，OD空白为空白组(含有细胞的培养基、MTT、不含药物)吸光度，OD实验为实验组(含有细胞的培养基、MTT、不同浓度的药物)吸光度。

1.6.3.2 流式细胞术检测细胞凋亡率

将对数生长期HCT116细胞以每孔4×105/mL个细胞接种于六孔板，培养24 h后按照槲皮素四个浓度0、50、100和200 μmol/L加入培养液100 μL/孔，继续培养48 h，消化、重悬细胞。按照说明书，每管加入500 μL的Binding Buffer轻轻悬浮细胞，加5 μL的Annexin V-FIT混匀后，再加入5 μL的PI轻轻混匀，并在室温下避光孵育5～15 min，最后分组使用流式细胞仪进行检测。

1.6.3.3 Western blot法检测蛋白表达

将对数生长期HCT116细胞按“1.6.3.2”项方法处理后，加入RIPA裂解液提取总蛋白，利用BCA测试盒测定蛋白浓度，取等量蛋白用10%SDS-PAGE胶电泳后湿转到PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭1 h，TBST洗膜3次，然后加一抗Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)4 ℃孵育过夜，次日用TBST洗膜3次后加入二抗，4 ℃摇床上孵育1 h后再次洗膜3次，最后按1∶1避光加入增强化学发光液(ECL)显影、定影，分析结果。

1.6.4 统计学方法

2.1 CMF活性成分靶获取

通过对僵蚕成分的2D结构、CAS号进行检索及筛选，符合条件的化合物有3个，乌梅符合条件的对应化合物有8个，为进一步检索各化合物对应靶点做准备。

2.2 CMF化学成分对应靶点的筛选

在TCMSP数据库及Swiss Target Prediction数据库对符合筛选条件的各化学成分对应靶点进行检索，其中僵蚕对应的靶点有227个，乌梅对应的靶点有239个，共466个药物成分靶点导入Cytoscape 3.7.2软件，绘制CMF活性成分治疗结直肠癌的网络图(见图1)。图中466条连线示意活性成分对共有靶点的作用，黄色表示药物活性成分与疾病相关靶点的共有靶点，紫色表示活性化合物。根据该网络拓扑分析的数据，槲皮素、山奈酚在CMF治疗结直肠癌过程中发挥重要作用(见表1)。

表1 CMF关键药效分子及拓扑参数(前5位)

将上述各化合物对应靶点合并，去除重复值后得到166个靶点，为进一步研究CMF防治结直肠癌的潜在机制做准备。

2.3 结直肠癌对应靶点

分别在GeneCards数据库和OMIM数据库以“colorectal cancer”为关键词检索，得到650、498个靶点，汇总并去除重复值，共获得1 028个疾病靶点。应用韦恩图取交集，得到79个共同靶点(见图2)。

图2 成分靶点-疾病靶点韦恩图

2.4 活性成分靶点-疾病蛋白相互作用网络构建

借助String数据库结合Cytoscape 3.7.2软件构建中药成分靶点-疾病蛋白PPI网络(79个节点，1 465条边)，设置score>0.7，得到CMF治疗结直肠癌靶点蛋白互作网络(见图3)。图中蛋白用节点表示，节点颜色和大小随degree值的大小改变，蛋白间的相互联系用连线表示，边的粗细随Combine score值的大小改变。结果表明：肿瘤抑制基因P53(TP53)、RAC-α丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶(AKT1)、丝裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、转录因子AP-1(JUN)、白细胞介素-6(IL6)靶点蛋白度值排名靠前，为关键靶点。

图3 CMF-结直肠癌靶点PPI网络图

2.5 关键靶点的GO富集结果

GO富集分析分为3类：分子功能(molecular function，MF)、生物过程(biological process，BP)和细胞组分(cellular components，CC)。利用Metascape平台对CMF治疗结直肠癌的潜在靶点进行GO分析，显示共有1 773个结果富集，其中BP相关的条目最多，有520条，主要涉及有凋亡信号通路、细胞对化学应激的反应、细胞死亡的正调控、炎症反应、上皮细胞增殖、对脂多糖的反应、活性氧代谢过程等方面，CC相关的条目有41条，主要涉及细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物、细胞器外膜、囊泡腔、RNA聚合酶II转录调节复合物等方面，MF相关的条目有123条，主要涉及有激酶结合、转录因子结合、泛素样蛋白连接酶结合、细胞因子受体结合、蛋白激酶活性等方面。将基因GO本体条目按P值进行排序，分别选取BP、CC和MF的前10绘制柱状图(见图4)。

图4 CMF治疗CRC的GO功能富集分析

2.6 KEGG通路富集结果

为了获取CMF治疗结直肠癌的潜在靶点主要富集的信号通路，利用Metascape平台对进行KEGG通路富集分析，以P<0.01作检验校正，筛选出富集最为显著的前20位的信号通路(见图5)。可见靶点富集得到的主要信号通路包括：癌症的途径、膀胱癌、IL-17信号通路、丙型肝炎、PI3K-Akt信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、铂类耐药、HIF-1信号通路、癌症中的转录失调、p53信号通路等途径。

图5 CMF治疗CRC的KEGG信号通路

2.7 “活性成分-靶点”分子对接

将“2.2”项下得到的核心活性成分山奈酚、槲皮素与关键靶点TP53、AKT1、MAPK8、MAPK1、JUN、IL6进行分子对接和结合能力预测。自由结合能越小，则表示受体与配体之间的亲和力越大(见表2)。并用PyMOL软件进行可视化处理(见图6、7)。结果显示，各活性成分与蛋白对接的结合自由能均小于-6 kJ/mol，表明各活性成分与各蛋白均有较高的亲和力，其中MAPK8与山奈酚亲和力最高，TP53与槲皮素亲和力最高。

图6 槲皮素与TP53蛋白对接图

表2 活性成分-靶点结合能

2.8 槲皮素对结肠癌HCT-116细胞增殖的影响

MTT实验表明，槲皮素对结肠癌HCT-116细胞的抑制率与空白组比较显著增高，差异具有统计学意义(P<0.01)，说明槲皮素能有效抑制结肠癌HCT-116细胞的增殖，且呈剂量依赖关系(见表3)。因高浓度组抑制率相近，故本研究后续实验分别采用0、50、100、200 μmol/L作为槲皮素的低、中、高剂量进行体外细胞研究。

图7 山奈酚与MAPK8蛋白对接图

表3 不同浓度槲皮素对HCT116增殖的抑制作用

2.9 槲皮素对结肠癌HCT-116细胞凋亡的影响

Annexin V-FITC/PI双染法结果显示，各浓度槲皮素均可诱导HCT116细胞凋亡，与空白组比较均有显著差异(P<0.01)，由图8可知，随着槲皮素浓度的增加，其诱导凋亡的作用逐渐增强，尤其表现在总凋及晚凋比例，并且呈剂量赖关系。

图8 不同浓度槲皮素对HCT116凋亡的抑制

2.10 槲皮素对结肠癌HCT-116细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、BAX的影响

Western blot结果显示(见图9)，随着槲皮素浓度的增加，Bcl-2的蛋白质水平明显减少，BAX的蛋白质水平显著增加，各浓度与空白组比较差异有统计学意义(P<0.01)。

图9 不同浓度槲皮素对HCT116凋亡蛋白的影响

本研究基于网络药理学、分子对接及实验验证，对CMF治疗结直肠癌的潜在作用机制进行了系统分析，构建僵蚕、乌梅活性成分-结直肠癌靶点网络，预测潜在作用靶点及信号通路，通过拓扑数据分析发现槲皮素、山奈酚可能在CMF治疗结直肠癌过程中发挥至关重要的作用。

研究表明，槲皮素具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、抗肿瘤和免疫抑制等药理学活性[8]，可以促进细胞凋亡和自噬，以及抑制血管生成和炎症来抑制结直肠癌的进展[9]。通过抑制MAPK/Erk、PI3K/Akt和NF-κB等信号通路诱导细胞凋亡[10,11]。天然黄酮醇山萘酚，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理学活性，并正在应用于癌症化疗。上述已有的研究结果与预测结果基本一致，提示CMF主要有效成分对防治结直肠癌具有确切治疗作用。

PPI蛋白互作网络分析结果得出，CMF防治结直肠癌的潜在靶基因有：TP53、AKT1、MAPK8、MAPK1、JUN、IL6。TP53是一种肿瘤抑制蛋白，通过促进细胞凋亡和DNA修复来严格调节细胞生长。研究表明，突变的TP53会导致结直肠癌患者癌细胞异常增殖和肿瘤进展[12]。AKT1(即AKT)是PI3K/AKT信号通路中的核心靶标，参与肿瘤细胞的生长、增殖、凋亡、代谢、肿瘤耐药和免疫逃逸[13]。MAPK1、MAPK8均是MAP激酶家族的成员。MAP激酶作为多种生化信号的整合点，参与多种细胞过程，如分化、增殖、转录调控等。实验证明，miR-422a通过靶向MAPK1和AKT1抑制结肠癌细胞增殖[14]。c-jun是JUN基因的一种蛋白，结直肠癌患者表现出对c-Jun的易感性，且与生存率密切相关[15]。IL-6是急性期炎症反应中的关键细胞因子，参与包括癌症在内的多种慢性炎症疾病的发病机制。IL-6家族细胞因子已被确定为检测癌症的生物标志物[16]。综上可见，CMF的有效成分靶点与大肠癌的疾病靶点相互作用，充分发挥中药治疗结直肠癌多成分、多靶点的独特优势。

GO功能及KEGG通路富集分析发现，CMF参与细胞增殖、细胞周期、凋亡、信号转导、氧化应激、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性的调节等生物过程；
癌症通路、IL-17信号通路、PI3K-AKT信号通路、HIF-1信号通路等通路富集的基因数量最多，表明这些通路可能在CMF治疗结直肠癌的作用机制中发挥重要作用。

细胞因子是癌症生长和侵袭的重要炎症介质。IL-17是Th17细胞产生的主要细胞因子，可诱导嗜中性粒细胞和巨噬细胞产生炎性细胞因子和趋化因子，参与包括宿主防御、组织修复、炎症性疾病的发病机制和癌症的进展等多种过程，在人类恶性肿瘤中起关键作用[17,18]。在肠道中，IL-17信号通过增强具有Apc突变的肠细胞的增殖和存活来促进腺瘤形成，损害肠道屏障功能，激活肿瘤内IL-17反应，促进肿瘤生长[19]。此外，IL-17诱导的细胞因子和趋化因子粒细胞动员抑制细胞，其促进血管生成和抑制抗肿瘤免疫[20-22]。PI3K/AKT/mTOR这一经典的自噬信号通路，参与了肿瘤细胞的生长、增殖、生存、凋亡、代谢以及肿瘤耐药和肿瘤免疫逃逸[23]。该信号通路的活化是癌症发生的标志[24-26]。在晚期乳腺癌、胃癌和结直肠癌等实体癌症中常见PI3K信号通路激活突变，该突变率增加可达30%～60%[27,28]。CMF有效成分可通过调控多条通路，影响结直肠癌的发生发展，这为临床治疗提供了新的思路。

“活性成分-靶点”分子对接结果显示CMF的核心活性成分槲皮素与山奈酚与关键靶点展现出较好的亲和力，且结合位点构象稳定，有较强的结合能力，也进一步验证了本研究网络药理学的预测。

基于上述研究结果，选择主要活性成分槲皮素作为后续细胞实验，深入探讨其潜在的机制。实验结果显示，不同浓度的槲皮素干预HCT116细胞后可显著抑制细胞增殖和促进细胞凋亡，降低抗凋亡蛋白Bcl-2表达、增加促凋亡蛋白BAX表达。差异均具有统计学意义(P<0.05)。

从系统生物学角度对CMF防治结直肠癌潜在机制进行预测结果的分析，符合中医运用复方中药多靶点、多途径、多系统，整体调理机体、防治疾病的特点，且有助于揭示中药复方科学内涵和指导中药新药研发。中药在肿瘤的预防和治疗方面有着广阔的前景，但是网络药理学研究方法存在一定的局限性，后期仍需开展多维度实验作进一步验证。

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