陈泓岑，刘世洲，王 乐，常可欣，卢天航，雒星辰，邓 杨，李子萱，刘博文，张永红 ，崔德凤

（北京农学院动物科学技术学院／兽医学（中医药）北京市重点实验室，北京 102206）

病毒、细菌和环境应激等诸多因素可诱发呼吸道疾病综合征（Porcine respiratory syndrome，PRDC），其病毒类病原主要包括猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV）、猪圆环病毒2型（Porcine circovirus，PCV2）、猪巨大细胞病毒等；
细菌类病原包括猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，App）、多杀性巴氏杆菌（Pasteurellamultocida，Pm）和副猪嗜血杆菌（ Haemophilus parasuis，Hs）等。呼吸道疾病综合征发病猪的主要症状为较高的体温，同时伴有咳嗽、体型消瘦、喘气、呼吸困难、食欲减退等症状，最终导致降低经济价值或死亡。本病主要发生于断奶仔猪，因为母乳中含有抗体，而断奶仔猪缺乏抗体会导致免疫功能低下而患病，本病的发病率高达30%～80%，且病死率高达5%～30%。呼吸道疾病综合征（PRDC）主要与规模化养猪场的密集养殖、通风不良、卫生环境不良和环境应激刺激等诸多因素有关，这些是引起该病在养猪业的发病率高的重要原因。一般而言，猪场在发生呼吸道疾病的前期，常见各种应激因素，如：寒冷潮湿、转群或运输、突然冷热交替、猪群密度大过于拥挤、氨气味过大、疫苗免疫等；
还有营养不良或不均衡、免疫力低和猪流感或感冒共同作用，故而使猪呼吸道疾病频频发作交叉感染，最终导致多种致病因素的混合感染，并导致死亡率增加。

1.1 猪传染性胸膜肺炎

放线杆菌可导致高传染性、高致死率的猪传染性胸膜肺炎。刘奎昊等人对山东某猪场的病死猪剖检，发现猪的心包有扩张、肺脏胸膜表面出现纤维素渗出，还有研究表明有的猪会出现淋巴结肿大。董发明等人对一猪场的传染性胸膜肺炎进行了调查，发现断奶仔猪和育肥猪的发病率高，最急性、急性、慢性型3种发病形式均存在，其中最急性型发病率仅0.98%，但是病死率极高，约为91.43%，呼吸困难是该病导致猪死亡的主要原因，病死猪皮肤往往呈现蓝紫色。该病在我国流行的血清型为1型、5型和7型。

1.2 猪支原体肺炎

猪肺炎支原体又称猪气喘病。有研究表明，该病在春冬季节的阳性检出率高，分别为66.67%和77.78%；
育肥猪以及繁育母猪阳性率较高，分别为63.41%和86.49%。李石对北疆地区的猪场发病情况进行调查后发现，染病后的猪会出现明显的咳嗽，腹式呼吸等症状，对病死猪进行剖检后发现肺部有不同程度的肺气肿和肺实变。

1.3 猪圆环病毒病

猪圆环病毒（PCV）是已知最小的动物病毒之一，现已知有四种血清型，主要病原为PCV2。在尹丽萍等人的研究中，41到90日龄的猪只PCV2抗体检出率最高，为47.92%；
PCV2还常与其他病原混合感染，其中与PRRSV的混合感染率最高为30.43%。PCV2可以造成母猪生殖障碍；
生长发育猪呼吸道疾病；
皮肤炎症和肾衰；
仔猪先天震颤，仔猪一出生就会震颤，也称“抖抖猪”和断奶仔猪多系统衰竭综合征，该病可直接、间接、垂直传播。

1.4 猪繁殖与呼吸综合征

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）主要引起病猪的皮肤发绀、呼吸障碍和双耳皮肤变蓝，所以又称为“蓝耳病”，可直接、间接和垂直传播。2020年一研究表明，保育猪阳性检出率最高，为32.24%，其次是哺乳猪，为19.09%。贾义平等人对一猪场的发病情况进行调查后发现该病可导致育肥猪发育缓慢，厌食沉郁，母猪流产，死胎，而后陆续传染到其他猪舍，仔猪舍和保育猪舍。

2.1 发病情况与样品采集

北京市某规模化养猪场自2021年9月以来，该场断奶仔猪（40日龄）进入保育舍20 d左右出现咳嗽、气喘、呼吸困难、持续性消瘦以及严重急性死亡等临床症状，通过统计后死亡率在10%～30%。对病死猪进行病理剖检，结果显示，肺组织有不同程度的间质性肺炎，肺组织间水肿，淋巴结肿胀出血；
肝肿大，呈黑褐色，有血水流出；
肾脏表面存在白色坏死斑点；
脾脏肿大，边缘呈锯齿状，部分呈黑褐色。选取病猪进行前腔静脉采血10 mL，于4℃ 3 000 r/min 离心20 min分离得到血清，用于后续病毒DNA、RNA的提取与鉴定。将病死猪进行剖检，采集肺脏、肝脏、 脾脏、肾脏、淋巴结、气管及支气管分泌物、扁桃体及渗出液进行常见病原检测。

2.2 主要试剂及仪器

LB营养琼脂购自北京奥博星生物技术有限责任公司，血琼脂平板、血清琼脂平板和巧克力琼脂平板自制，革兰氏染色液购自碧云天，细菌核酸提取试剂盒购自康为世纪，病毒 DNA/RNA提取试剂盒、2×Pro Taq预混液、Evo M-MLV反转录预混型试剂盒购自艾科瑞生物；
PCR引物为生工生物工程（上海）股份有限公司合成。电泳仪（WH-600-LCD）购自上海双琪生物科技有限公司，PCR仪T100购自Bio-Rad，全自动高压灭菌锅TMQR-3250购自山东新华医疗器械有限公司。

2.3 实验方法

2.3.1 样品处理

将猪场采集的病猪组织切成小块，用剪刀剪碎，放入组织匀浆器中，加入适量灭菌PBS缓冲液反复研磨，置-80℃的超低温冰箱内反复冻融3次以上，最后将组织匀浆离心，提取上清液备用。

2.3.2 病毒DNA和RNA的提取

用制备好的组织匀浆上清液及血清作为待检样本，采用 Steady Pure 病毒DNA/RNA 提取试剂盒，依据试剂盒说明书进行病毒核酸提取、纯化，将得到的 DNA和RNA保存于-20℃冰箱中备用。

2.3.3 cDNA的制备

将提取的病毒RNA根据反转录试剂盒说明书进行 PT-PCR扩增，首先去除基因组DNA，5Xg DNA Clean Reaction Mix加 入 2μL和RNA样本8μL，反应条件：42℃2 min后进行反转录反应，然后将该病毒的cDNA置于-20℃冰箱保存。

2.3.4 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）

PRRSV和PCV2的检测都选择20μL的反应体系，反应体系为 10μL 的 2×SYBRGreen Pro Tap HS Premix；
上游引物和下游引 物 各 0.4 μL；
模 板 2.0 μL；
ROX Reference Dye（20μmol/L）0.4 uL；
RNase Free dH2O 为6.8 μL。PRRSV的引物F为AAT AACAACGGCAAGCAGCAG；
R为CCTCTGGACTGGTTTTGT反应条件为95℃预变性30 s；
然 后 95℃ 5 s，55℃ 30 s重 复40个 循 环。PCV2的 引 物F为GCGGGCCAAAAAAGGTACAG TTCC；
R为 ACCAGCGCACTT CGGCAGCGGCAG，反应条件为95℃预变性 30 s；
然后 95℃ 5 s，66℃ 30 s重复40个循环。各自分别使用10倍稀释的自建标准质粒进行绝对定量PCR扩增。

2.3.5 PCR扩增

PCR扩增体系为2×Pro Taq预混液10 μL，上游引物和下游引物（10 μmol/L） 各 1 μL，cDNA模板2μL，无酶无菌水6μL；
反应条件为先94℃预变性3 min，然后94℃变性30 s，退火45 s（退火温度根据表1中各自的退火温度设定），72℃延伸 45 s，35个循环，72℃延伸7 min。取5μL扩增终产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条件110 V，30 min。

2.3.6 细菌分离

从病死猪采集的脏器等样品，用烧灼灭菌的接种环钓取组织，进行血清营养肉汤增菌37℃培养24 h，分别划线接种于血琼脂平板、血清琼脂平板、巧克力琼脂平板，置于37℃恒温箱培养24 h；
进行细菌纯培养，细菌形态观察和细菌16SrRNA鉴定。采用细菌16SrRNA 通用引物和特异性引物，详见表1，按照细菌常规方法进行PCR扩增，凝胶电泳成像，观察结果。

表1 病原菌和病毒引物序列

2.3.7 病原菌和病毒引物

3.1 PRRSV检测结果

根据本研究设计的以PRRSV ORF7基因为目的片段的引物，对19个血清样品进行了PRRSV检测，PRRSV阳性样品可于434 bp处看见高亮条带。如图1中样 本 编 号 3、5、6、7、11、12、13、15、16、17、18、19的 样本在434 bp处可以观察到阳性条带。

图1 PRRSV RCR电泳结果

使用PRRSV N蛋白基因特异性引物，对PRRSV阳性样本进行实时荧光定量PCR检测病毒载量，检测结果与普通PCR结果相一致，其中编号为17、18的样本PRRSV N蛋白mRNA表达量较高（见图2）。

图2 PRRSV阳性样本qRT-PCR结果

在 19 份血清样品中检出PRRSV 阳性有12份，检出率为63.15%。据了解，该猪场目前正在使用天津株猪蓝耳病弱毒疫苗，经过基因序列比较，结果表明，所检出病毒不属于疫苗毒株，而属于流行毒株。

3.2 PCV2检测结果

运用普通PCR的方法对9份组织样品与10份血清样品进行猪圆环病毒2型（PCV2）的检测，PCV2阳性样品可于494 bp处看见高亮条带。如图3中样本编号为1、4、5、8、10的样本在494 bp处可以观察到阳性条带。

图3 PCV2 PCR电泳结果

使用PCV2 Cap蛋白基因特异性引物，对PCV2阳性样本进行实时荧光定量PCR检测，结果与普通PCR 电泳结果相一致，其中编号为4的样本PCV2 Cap蛋白mRNA表达量最高（见图4）。

图4 PCV2阳性样本qRT-PCR结果

在9个组织样品本中，4份样品检出PCV2，在10个血液样本中，1个样本检出PCV2，累计检出率达26.3%。据了解，该场目前采用的是PCV2 2a型猪圆环病毒疫苗，经基因序列比较，显示PCV2病毒为2d型。

3.3 细菌检测结果

通过细菌分离培养，PCR扩增SS、App、Pm、MH的核酸，病原菌均未检出，结果都为阴性。

3.4 检测结果统计

在检测的19例断奶仔猪的样品中，有12例感染PRRSV和5例感染PCV2，检测样品中未捡出SS、Hps、Pm、Bb等病原。经基因序列比较，结果显示，PRRSV和PCV2与接种疫苗的基因序列存在很大的差异。

猪呼吸道传染病是集约化猪场养殖中的大问题，猪场因此病引发的经济损失也是不可估量的。该病的发病率约在30%～80%之间，病死率在5% ～ 30%之间，甚至会超过上限值。在该猪场的19例病猪中，PRRSV的检出率是63.15%，PCV2的检出率为26.3%，虽然该猪场已经接种过疫苗，但是由于基因型不一致而导致免疫效果不理想，而无法起到有效的保护作用。

有研究表明，从2015到2019年我国各地发现PCV2的总患病率为46%，母猪患病率为48.8%，公猪患病率为47.6%，新疆的患病率最高为86.3%。PCV2进入机体以后，可感染淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞等，引起免疫抑制；
PCV2感染淋巴组织后，可导致淋巴细胞凋亡、破坏淋巴滤泡结构，淋巴组织流失并被结缔组织取代，最终导致免疫抑制，机体对其他病原的抵抗能力减弱导致继发感染。有研究表 明，2016-2018年PRRSV的 检出率逐年上升，从21.08%上升到41.72%，并且育肥猪、保育猪和哺乳仔猪的感染比例分别为35.29%、41.83%和56.67%。在猪场中，PRRSV与PCV2常常处于共感染状态，并且这种状态有助于PCV2的复制，在共同感染状态下，病猪的临床症状要比单独感染更强，死亡率也更高。

养猪场在疫病防治上不能松懈，在加强硬件设备基础的同时应着重加强对病毒的管理，加强对疾病的防治。同时，兽医应适时、有序地对猪场的免疫情况进行监控、评价，并制定出一套科学、有效的疫苗接种方案，这对提高养猪场的经济效益、提高生产的稳定性起到了关键作用。从养猪的饲养管理上，对存在的问题进行及时的补漏，才能达到预防或减少疫情发生的目的。

防控措施：

1）接种疫苗，在猪场采集样本送实验室检查，针对猪场现有病原接种相应疫苗；

2）使用抗菌药，如泰乐菌素、恩诺沙星等药物，以“预防为主，治疗为辅”为用药原则；

3）合理运用中药、中药组方及其衍生物等作为饲料预添加剂来达到预防疾病的作用，如蒲公英、淫羊藿、板蓝根等；

4）改善猪场的饲养环境：

①断奶仔猪不能密度太大，会影响采食、饮水和休息，主要容易产生应激；

②保持每天通风、换风，保持环境卫生干净；

③本病在秋冬季节要做好猪舍的防寒、保温工作，以免天气骤变对生猪产生应激，降低其免疫力；

④对病死猪及时进行隔离以及无害化处理，以免造成大面积传染。

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