罗江辉，毛远舟，张可贤，邹 江

(四川省肿瘤医院麻醉科，成都 610041)

宫颈癌为常见的妇科恶性肿瘤，是女性恶性肿瘤相关死亡的主要原因[1]。虽然放疗、化疗和手术等治疗方法已经取得了很大的进展，但由于肿瘤的转移和复发，宫颈癌患者的总体生存率仍然很低[2]。因此，阐明宫颈癌的发病机制，寻找宫颈癌治疗的新靶点是迫切需要解决的问题。丙泊酚是外科手术中用于诱导和维持全身麻醉的静脉麻醉药[3]。除麻醉作用外，丙泊酚还被证实对骨肉瘤、肝癌和胰腺癌等多种人类恶性肿瘤具有抗肿瘤作用[4-6]。此外，已有文献证明，丙泊酚可以通过调节微小RNA(miRNA)来抑制肿瘤的进展，如丙泊酚通过miR-195-5p/Snail轴减少胃癌细胞上皮-间质转化、侵袭和迁移[7]。miRNA是一类具有约22个核苷酸的高度保守的非编码RNA，可以结合mRNA的3′非翻译区(3′UTR)来阻止靶基因的翻译和表达[8]。miRNA在多种细胞生物学过程中具有关键作用，如炎症、细胞周期调节、应激反应、分化、凋亡和侵袭等[9-10]。越来越多的证据表明，miRNA参与影响宫颈癌细胞的增殖、迁移或侵袭能力。研究结果表明，miR-489通过PI3K/Akt/P53信号通路抑制宫颈癌细胞增殖[11]。Su等[12]的研究结果证实，miR-200a通过靶向EGLN1促进宫颈癌细胞增殖。此外，miR-802也被发现参与肿瘤的发生和发展，并在不同类型的肿瘤中发挥重要的作用[13]。然而，关于miR-802在宫颈癌中的作用研究有限。PTCH1为Sonic Hedgehog(SHH)信号通路中Sonic Hedgehog配体的膜受体。近年来研究报道，抑制PTCH1可显著减少非小细胞肺癌细胞的迁移和侵袭[14]。因此，本研究旨在探讨丙泊酚对宫颈癌细胞活力、迁移和侵袭能力的影响及潜在分子机制，为丙泊酚在宫颈癌治疗中的临床应用提供新的见解和理论基础。

1.1 实验细胞

人宫颈癌细胞HeLa(中国科学院生物化学与细胞生物学研究所)。

1.2 仪器

Varioskan LUX多功能酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；
Applied Biosystems 7500型荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪(美国ABI公司)。

1.3 药品与试剂

丙泊酚(广州隽沐生物科技股份有限公司)；
miR-802模拟物(miR-802 mimic)、阴性对照(NC mimic)、miR-802抑制剂(miR-802 inhibitor)、NC抑制剂(NC inhibitor)、PTCH1过表达载体(pcDNA-PTCH1)和过表达对照载体(Vector)均购于上海吉玛制药技术有限公司；
LipofectamineTM2000转染试剂(美国Invitrogen公司)；
PrimeScript RT试剂盒(日本Takara公司)；
SYBR Green试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；
RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；
PTCH1、Gli1抗体(美国Abcam公司)。

2.1 细胞培养与转染

人宫颈癌细胞HeLa在含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液的RPMI 1640培养基中，于37 ℃、5% CO2的培养箱中进行培养。将HeLa细胞接种到24孔板中，按照说明书使用LipofectamineTM2000转染试剂分别将NC mimic、miR-802 mimic、miR-802 inhibitor、NC inhibitor、miR-802 mimic联合Vector及miR-802 mimic联合pcDNA-PTCH1转染至HeLa细胞中，分别命名为NC mimic组、miR-802 mimic组、miR-802 inhibitor组、NC inhibitor组、miR-802 mimic+Vector组及miR-802 mimic+pcDNA-PTCH1组。此外，使用转染试剂分别将 NC inhibitor、miR-802 inhibitor、Vector和pcDNA-PTCH1转染至10 μg/mL丙泊酚处理的HeLa细胞中，分别命名为丙泊酚+NC inhibitor组、丙泊酚+miR-802 inhibitor组、丙泊酚+Vector组以及丙泊酚+pcDNA-PTCH1组。

2.2 丙泊酚治疗

将丙泊酚溶解于二甲基亚砜中，与培养基混合至二甲基亚砜的最终剂量<0.1%。将人宫颈癌细胞HeLa细胞随机分为对照组(使用二甲基亚砜处理细胞)、5 μg/mL丙泊酚组(使用5 μg/mL丙泊酚处理细胞)和10 μg/mL丙泊酚组(使用10 μg/mL丙泊酚处理细胞)，48 h后收集细胞用于后续实验。

2.3 噻唑蓝[3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，MTT]实验

将2×103HeLa细胞接种至含有RPMI 1640培养基的96孔板上，在37 ℃下孵育24 h。然后将MTT 20 μL加入每个孔中，并在37 ℃下再孵育4 h。然后弃去上清液，并向每个孔中加入二甲基亚砜150 μL。用微孔板读数器在490 nm处测量吸光度。实验重复3次。

2.4 Transwell实验

侵袭实验是将1×104HeLa细胞接种于不含胎牛血清的RPMI 1640培养基100 μL中，预先在上室顶部添加基质胶。然后将含10% FBS的培养基500 μL加入下室，在37 ℃下孵育24 h。然后取出Transwell用PBS洗3次，用棉签擦拭上表面的细胞。下表面细胞用甲醇固定，0.1%结晶紫染色，显微镜下随机5个视野计数。迁移实验与侵袭实验方法相似，除了添加基质胶。

2.5 实时定量PCR(RT-qPCR)

使用Trizol试剂提取各组细胞中的总RNA，并使用PrimeScript RT试剂盒将总RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板，使用SYBR Green试剂盒进行RT-qPCR反应。U6和GAPDH分别为miRNA和mRNA的内部对照。所有实验重复3次，使用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

2.6 蛋白质印迹法

使用预冷的RIPA缓冲液裂解细胞提取总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白质的浓度。然后用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶分离等量的蛋白质，转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，在5%脱脂奶粉中室温(25 ℃)下封闭2 h。然后将PVDF膜与一抗在4 ℃下孵育过夜。用PBS洗涤3次后，将膜与辣根过氧化物酶结合的第二抗体在室温下孵育2 h。用增强化学发光法观察免疫反应条带，用Image J软件分析蛋白表达水平。

2.7 双荧光素酶报告基因实验

使用在线TargetScan(http://www .targetscan.org)预测miR-802的下游基因。PTCH1被确定为miR-802的潜在靶点。然后用pGL3-promoter载体构建荧光素酶报告基因质粒PTCH1-WT或PTCH1-MUT。将HeLa细胞以每孔2×105个细胞接种于24孔板中，并使用LipofectamineTM2000试剂将PTCH1-WT、PTCH1-MUT和miR-802 mimic或NC mimic共转染48 h。最后根据说明书使用双荧光素酶报告基因分析系统检测荧光素酶活性。

2.8 统计学方法

3.1 丙泊酚对HeLa细胞活力、侵袭和迁移的影响

与对照组比较，不同浓度丙泊酚处理的HeLa细胞数量显著减少，呈浓度依赖性，差异有统计学意义(P<0.05)。选择10 μg/mL丙泊酚用于进一步实验，MTT结果显示，丙泊酚组HeLa细胞活力较对照组显著降低；
Transwell实验结果显示，丙泊酚组HeLa细胞侵袭和迁移能力较对照组显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1。

A. 细胞计数法检测细胞数量；
B. MTT法检测细胞活力；
C. Transwell实验检测细胞侵袭和迁移能力；
与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01A. cell counting was used to detect cell number; B. MTT was used to detect cell viability; C. Transwell was used to detect cell invasion and migration; vs. the control group, *P<0.05, **P<0.01图1 丙泊酚对HeLa细胞活力、侵袭和迁移的影响Fig 1 Effects of propofol on viability, invasion and migration of HeLa cells

3.2 过表达miR-802对HeLa细胞活力、侵袭和迁移的影响

RT-qPCR结果显示，与对照组比较，不同浓度丙泊酚处理的HeLa细胞中miR-802的表达呈浓度依赖性增加(P<0.05)。与NC mimic比较，miR-802 mimic组HeLa细胞中的miR-802表达水平显著升高，细胞活力降低，侵袭和迁移能力降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图2。

A—B. RT-qPCR检测miR-802的表达；
C. MTT法检测细胞活力；
D. Transwell法检测细胞侵袭和迁移能力；
与NC mimic比较，*P<0.05A-B. RT-qPCR was used to detect the expression of miR-802; C. MTT was used to detect cell viability; D. Transwell was used to detect cell invasion and migration; vs. the NC mimic group, *P<0.05图2 过表达miR-802对HeLa细胞活力、侵袭和迁移的影响Fig 2 Effect of overexpression of miR-802 on viability, invasion and migration of HeLa cells

3.3 丙泊酚通过靶向miR-802对HeLa细胞活力、侵袭和迁移的影响

与对照组比较，丙泊酚+NC inhibitor组HeLa细胞中miR-802表达水平显著升高，细胞活力降低，侵袭和迁移能力降低；
与丙泊酚+NC inhibitor组比较，丙泊酚+miR-802 inhibitor组HeLa细胞中miR-802表达水平显著降低，细胞活力显著增强，侵袭和迁移能力显著增强，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图3。

A. RT-qPCR检测细胞中miR-802的表达；
B. MTT法检测细胞活力；
C. Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力；
与对照组比较，*P<0.05；
与丙泊酚+NC inhibitor组比较，#P<0.05A. RT-qPCR was used to detect the expression of miR-802; B. MTT was used to detect cell viability; C. Transwell was used to detect cell invasion and migration; vs. the control group, *P<0.05; vs. the propofol+NC inhibitor group, #P<0.05图3 丙泊酚通过靶向miR-802对HeLa细胞活力、侵袭和迁移的影响Fig 3 Effects of propofol on viability, invasion and migration of HeLa cells by targeting miR-802

3.4 miR-802靶向PTCH1并调节SHH信号通路

通过分析TargetScan软件，发现PTCH1为miR-802的直接靶基因，PTCH1 3′UTR与miR-802序列之间具有潜在结合位点。双荧光素酶报告基因实验结果显示，与NC mimic组比较，miR-802 mimic+PTCH1-WT组HeLa细胞中的荧光素酶活性显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，而miR-802 mimic+PTCH1-MUT组HeLa细胞中的荧光素酶活性无显著性变化(P>0.05)；
与NC inhibitor比较，miR-802 inhibitor组细胞中PTCH1 mRNA和蛋白水平显著升高，Gli1蛋白表达水平显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图4。

A. 双荧光素酶报告基因实验验证miR-802与PTCH1的关系；
B. RT-qPCR检测PTCH1的转染效率；
C. 蛋白质印迹法检测PTCH1、Gli1蛋白的表达；
与NC inhibitor组比较，*P<0.05A. relationship between miR-802 and PTCH1 was verified by dual luciferase reporter gene assay; B. transfection efficiency of PTCH1 was detected by RT-qPCR; C. expression of PTCH1 and Gli1 protein were detected by Western blotting; vs. the NC inhibitor group, *P<0.05图4 miR-802靶向PTCH1并对SHH信号通路的影响Fig 4 miR-802 targeting PTCH1 and its effects on SHH signaling pathway

3.5 miR-802通过靶向PTCH1对HeLa细胞活力、侵袭和迁移的影响

与miR-802 mimic+Vector组比较，miR-802 mimic+pcDNA-PTCH1组HeLa细胞中PTCH1 mRNA和蛋白表达水平显著升高，细胞活力显著增强，侵袭和迁移能力显著增强，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图5。

A—B. RT-qPCR和蛋白质印迹法检测HeLa细胞中PTCH1 mRNA和蛋白表达；
C. MTT法检测细胞活力；
D. Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力；
与miR-802 mimic+Vector组比较，*P<0.05A-B. RT-qPCR and Western blotting were used to detect the mRNA and protein expression of PTCH1 in HeLa cells; C. MTT was used to detect cell viability; D. Transwell was used to detect cell invasion and migration; vs. the miR-802 mimic+Vector group, *P<0.05图5 miR-802通过靶向PTCH1对HeLa细胞活力、侵袭和迁移的影响Fig 5 Effects of miR-802 on viability, invasion and migration of HeLa cells by targeting PTCH1

3.6 PTCH1过表达对丙泊酚介导的HeLa细胞活力、侵袭和迁移的影响

与对照组比较，丙泊酚+Vector组HeLa细胞中PTCH1 mRNA和蛋白表达水平显著降低，细胞活力降低，侵袭和迁移能力降低；
与丙泊酚+Vector组比较，丙泊酚+pcDNA-PTCH1组HeLa细胞中PTCH1 mRNA和蛋白表达水平显著升高，细胞活力显著增强，侵袭和迁移能力显著增强，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图6。

A—B. RT-qPCR和蛋白质印迹法检测HeLa细胞中PTCH1 mRNA和蛋白表达；
C. MTT法检测细胞活力；
D. Transwell法检测细胞迁移和侵袭；
与对照组比较，*P<0.05；
与丙泊酚+Vector组比较，#P<0.05A-B. RT-qPCR and Western blotting were used to detect the mRNA and protein expression of PTCH1 in HeLa cells; C. MTT was used to detect cell viability; D. Transwell was used to detect cell invasion and migration; vs. the control group, *P<0.05; vs. the propofol+Vector group, #P<0.05图6 PTCH1过表达对丙泊酚介导的HeLa细胞活力、侵袭和迁移的影响Fig 6 Effects of overexpression of PTCH1 on propofol-induced viability, invasion and migration of HeLa cells

尽管宫颈癌筛查已广泛应用，但宫颈癌仍是影响我国女性的主要妇科恶性肿瘤之一。化疗为宫颈癌的常见干预措施，可以作为主要治疗或新辅助治疗[15]。由于单一药物疗法在复发性和转移性宫颈癌化疗中的作用有限，临床研究人员开始研究铂类药物化疗的疗效。拓扑替康或紫杉醇联合顺铂为最常见的化疗方式。然而，随着联合化疗疗效的提高，毒性也随之增加，尤其是血液学毒性[16]。因此，需要研究具有与传统药物完全不同的抗肿瘤作用机制的新药，以提高治疗效果。最近，麻醉药的使用在恶性肿瘤治疗中引起了广泛关注。Yang等[17]发现，丙泊酚可显著抑制胃癌细胞增殖，并显著促进其凋亡。Sun等[18]证实，丙泊酚通过下调miR-372来调节肺癌细胞的恶性行为。本研究验证了丙泊酚在宫颈癌中的作用，结果显示，丙泊酚治疗明显抑制了HeLa细胞的活力、侵袭和迁移能力。

以往的研究结果表明，丙泊酚通过靶向miRNA发挥其对肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。在宫颈癌中，丙泊酚通过调控miR-125a/LIN28B抑制卵巢癌的增殖和转移[19]。丙泊酚通过上调miR-328和下调ADAM8抑制胰腺癌的增殖和转移[20]。本研究中观察到，丙泊酚对HeLa细胞的活力、迁移和侵袭能力具有显著抑制作用，随后探讨了丙泊酚对宫颈癌细胞作用的潜在分子机制。

先前的研究结果发现，过表达miR-802直接靶向RAN，抑制结直肠癌细胞迁移和侵袭[21]。miR-802通过靶向原癌基因MET抑制口腔鳞癌的生物学行为[22]。在宫颈癌中，miR-802通过靶向SRSF9抑制恶性肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡[23]。miR-802可能通过降低BTF3的表达水平来抑制宫颈癌的进展[24]。本研究结果与之一致，过表达miR-802明显抑制了HeLa细胞的活力、迁移和侵袭。本研究还证实了丙泊酚对HeLa细胞的抑制作用是由于上调miR-802引起的。

SHH信号通路参与调控转移性肿瘤，并与增加的转移潜能和组织侵袭有关，抑制该途径可减少肿瘤细胞增殖[25]。PTCH1为Sonic Hedgehog通路的肿瘤抑制蛋白。有报道称PTCH1在治疗恶性肿瘤中具有重要作用，如PTCH1还可作为非小细胞肺癌的潜在生物标志物[26]。PTCH1突变与乳腺癌患者早期复发相关，并将成为乳腺癌复发的有力预测因素[27]。SHH配体诱导其靶基因之一Gli1基因的表达，而Gli1蛋白通过与其启动子结合来调控靶基因的表达并促进肿瘤的发生[28]。此外，研究结果表明，PTCH1功能丧失可能导致Gli1的转录激活[29]。本研究结果证明，PTCH1为miR-802的靶基因并且被miR-802负调控。过表达miR-802导致PTCH1表达下调，随后Gli1表达增加。本研究进一步发现，miR-802通过靶向PTCH1阻碍了HeLa细胞的生存力、迁移和侵袭，而PTCH1的上调可以部分缓解丙泊酚或miR-802介导的对HeLa细胞的抑制作用，提示miR-802通过调控PTCH1激活SHH通路参与HeLa细胞的活力、迁移和侵袭。

综上所述，本研究发现了丙泊酚对宫颈癌HeLa细胞生长、迁移和侵袭能力的抑制作用，进一步阐明了丙泊酚介导的对HeLa细胞的作用机制，即丙泊酚通过调节miR-802/PTCH1/SHH轴来抑制宫颈癌细胞的迁移和侵袭，可能为进一步在宫颈癌手术治疗中应用丙泊酚以改善肿瘤预后和生存率提供直接证据。然而，本研究仍存在局限性，仅通过体外实验研究了丙泊酚在宫颈癌中的作用，丙泊酚的作用还有待于进一步的体内实验证明。此外，手术期间的麻醉类型是否影响早期恶性肿瘤患者的生存期和进展时间也有待进一步探讨。后续应通过临床数据收集和统计研究，为丙泊酚是否在宫颈癌预后方面具有优势提供更多证据。

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