宁心暖，李 洁，房 辉，余思源，梁家禧，张 璐，靳亚平，周 栋

(西北农林科技大学动物医学院 农业部动物生物技术重点实验室， 杨凌 712100)

根据奶牛分娩过程中的生理及产道变化、胎儿及胎衣在产道中的运行特点等，可将奶牛的正常分娩过程分为3个阶段，即子宫颈口开张期、胎儿产出期、胎衣排出期。在奶牛分娩时，胎儿在奶牛努责2～4 h后仍未被排出即可判定发生难产[1]。难产由多种因素引起[2]，会增加母牛淘汰率，严重者甚至引起母牛死亡，严重影响奶牛繁育工作[3-5]。在牧场产房接产数据记录中，一般用4分制来记录产犊的难易程度[6]。产犊评分2分及以上为辅助产犊，即助产。助产是当母牛不能够完成自然分娩时，需要进行的人工辅助产犊措施，而在产犊过程中，助产的发生非常普遍。产后健康的子宫在以前通常被认为是无菌的[7]，但最近的研究表明，子宫并非无菌的，并有特定的微生物群[8-9]。Moore等[10]在未受精的青年牛和怀孕母牛子宫内均检测到了微生物，且证实了建立和维持妊娠需要有菌坏境。Serrano等[11]发现绵羊生殖道的微生物组成是导致人工输精成败的主要原因。近年来，国内外学者对奶牛难产的研究有所增加，随着基因序列和功能基因筛选以及高通量测序等技术的进步，对于子宫健康和疾病相关的微生物组有了进一步的认识[12-13]。临床奶牛子宫内膜炎发病与化脓隐秘杆菌(Truperellapyogenes)关系密切，病例中也常分离到大肠杆菌(Escherichiacoli)、坏死梭杆菌(Fusobacteriumnecrophorum)、产黑素普氏菌(Prevotellamelaninogenica)、拟杆菌(Bacteroidesspp)等；
而健康奶牛在产后10 d内，从奶牛子宫中分离率最高的细菌种类是链球菌属(Streptococcusspp.)、葡萄球菌属(Staphylococcusspp.)和芽胞杆菌属(Bacillusspp.)，这些菌种的出现，通常不会引起奶牛发生具有明显临床症状的产后子宫疾病[14]。

大量研究表明，采用助产方法会导致母牛受胎率降低、冻精使用量增加、空怀时间增加和首次配种时间后移等繁殖问题[15-16]。推测与子宫内菌群的改变、子宫免疫屏障的损伤有关，但具体机制尚未阐述清楚。本研究以助产和非助产奶牛为研究对象，通过子宫灌洗液细菌的分离培养、16S rRNA测序等方法，以期从细菌学角度，分析助产导致繁殖和生产性能降低的原因，为牧场产房和新产牛管理提供指导性的建议。

1.1 材料

1.1.1 实验动物 根据产犊难易程度分为1～4级：1级为顺产，2级为牵拉助产，3级为器械助产，4级为剖腹产。产犊难度评分1的为顺产(非助产)，产犊难度评分2～4的为难产(助产)。

本试验在2021年挑选无产道撕裂、阴道、宫颈损伤、剖宫产史、患子宫炎、子宫内膜炎、子宫积脓、胎衣不下、乳房炎等产科疾病，无酮病、蹄病、真胃变位等常见疾病，且体温低于39.5 ℃的奶牛。记录牛号、产犊时间、是否助产以及用药等情况。奶牛产犊后45 d，剔除因疾病接受药物治疗的奶牛。根据有无助产的情况，随机采集4份助产(产犊评分3分)和3份非助产(产犊评分1分)奶牛的子宫灌洗液样本，放入装有冰袋的保温箱，立即送回实验室，进行后续试验。

1.1.2 主要试剂 无菌生理盐水、绵羊血琼脂平板、LB培养基，青岛科源生物科技有限公司产品；
2×Taq Starmix、DNA ladder 2 000，大连TaKaRa公司产品。

1.1.3 主要仪器 普通生物显微镜，日本Nikon公司产品；
PCR仪，Bio-RAD公司产品，细菌培养恒温摇床，上海智诚分析仪器有限公司产品；
凝胶成像仪，syngene公司产品；
微量加样枪，Eppendorf公司产品。

1.2 方法

1.2.1 奶牛子宫灌洗液的采集 随机选取助产奶牛和非助产奶牛，在产后45 d利用无菌的子宫冲洗液导管进行子宫灌洗液采集。奶牛保定完全后，消毒奶牛阴门，经直肠把握子宫颈后，将套有输精枪外套的子宫冲洗导管经奶牛阴门伸入到子宫颈，隔绝产道污染。当导管尖端到达子宫后，去掉输精枪外套，导管注入空气进行固定，拔出探针后，经导管口注入50 mL无菌生理盐水，经直肠按摩子宫后，回抽子宫灌洗液。将获得的灌洗液快速无菌转入到50 mL离心管，放入装有冰袋的保温箱，立即送回实验室，进行细菌分离培养。

1.2.2 细菌的分离培养 将子宫灌洗液颠倒混匀后，用无菌棉棒蘸取灌洗液，均匀地涂布于血琼脂平板，倒置于37 ℃培养箱中进行培养，经16～24 h后，观察血平板细菌菌落形态，选择形态单一的菌落，继续在LB琼脂平板上划线纯化培养，选取单菌落进行镜检，确定纯度后接种于LB液体培养基，过夜培养，保存菌种后进行后续试验。

1.2.3 16S rRNA测序 利用上述培养的细菌为模板，进行菌体PCR扩增16S rRNA。引物序列：F-5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′、R-5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，预期克隆片段长度为1 492 bp；
PCR反应体系：12.5 μL 2 ×Taq Starmix，上、下游引物各0.5 μL，1.0 μL模板，10.5 μL ddH2O。同时设置阴性对照，反应条件：94 ℃ 5 min；
94 ℃ 30 s，50 ℃，30 s，72 ℃ 2 min，30个循环；
72 ℃延伸10 min。取5 μL产物通过1%琼脂糖凝胶电泳观察结果后，剩余产物进行测序，测序结果与NCBI数据库进行比对，确定细菌种属。

2.1 冲洗液培养结果

4份助产(产犊评分3分)和3份非助产(产犊评分1分)奶牛子宫灌洗液样本，经血琼脂平板分离培养，结果显示助产组分离出14株细菌，非助产组分离出6株细菌，其中，有9株细菌有溶血环，11株无溶血环。按镜检结果及血平板形态，革兰阳性菌的主要为气球菌、葡萄球菌、棒状杆菌和链球菌，革兰阴性菌以肠杆菌属为主。气球菌菌落主要为乳白、针尖大小，圆形，α溶血；
葡萄球菌菌落直径1～3 mm，乳白色或黄色，不透明，边缘整齐，不溶血；
棒状杆菌菌落直径1～2 mm，乳白色，不溶血；
链球菌在血琼脂平板上菌落光滑，乳白色，α溶血。革兰阴性杆菌肠杆菌菌落边缘整齐，圆形，乳白色，直径3～5 mm，α溶血或不溶血。

2.2 16S rRNA测序结果及分析

对分离得到的20株微生物进行16S rRNA测序。经PCR检测，各株细菌均能扩增出阳性条带，大小为1 492 bp，符合预期，部分菌株的电泳结果见图1。

M. DNA相对分子质量标准；
1～14.细菌菌株M. DNA marker; 1-14. Bacteria strains图1 部分细菌16S rRNA PCR产物电泳结果Fig.1 Electrophoresis results of 16S rRNA PCR products of some bacteria

测序结果经与NCBI数据库进行比对，结果显示共分离到10个属的细菌，包括棒状杆菌属、气球菌属、志贺菌属、不动杆菌属、假单胞菌属、芽胞杆菌属、肠杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属等10个细菌属，12种细菌组成，详见表1。

其中，非助产奶牛子宫冲洗液分离出链霉菌属(16.67%)、链球菌属(16.67%)、肠杆菌属(33.33%)、葡萄球菌属(16.67%)、气球菌属(16.67%)5个属的细菌，分别为吖啶霉素链霉菌、多动物链球菌、费格森埃希菌、沃氏葡萄球菌、脲气球菌，见表2。

助产奶牛子宫冲洗液分离出志贺菌属(7.14%)、不动杆菌属(7.14%)、气球菌属(28.58%)、假单胞菌属(7.14%)、棒状杆菌属(21.43%)、芽胞杆菌属(7.14%)、肠杆菌属(7.14%)、葡萄球菌属(7.14%)、链球菌属(7.14%)9个属的细菌，共10种细菌，分别为宋内氏志贺菌、不动杆菌、绿色气球菌、脲气球菌、摩氏假单胞菌、银色棒状杆菌、地衣芽胞杆菌、费格森埃希菌、表皮葡萄球菌、多动物链球菌，详见表3。

表1 子宫冲洗液分离鉴定微生物结果

表2 非助产奶牛子宫冲洗液微生物分离鉴定结果

表3 助产奶牛子宫冲洗液微生物分离鉴定结果

大量研究表明，奶牛正常子宫内并非无菌，而是由特定的需氧、兼性厌氧和专性厌氧微生物群组成[3，17]。产后2周内，90%以上的奶牛子宫内受到不同程度的细菌污染[18]，在之后的45 d内，大多数的污染会被子宫清除，但仍会有10%左右的奶牛子宫内存留不同致病菌，这主要是由于子宫内细菌种类、产后奶牛饲养管理、免疫状态、激素水平等造成，但助产是否影响子宫内菌群变化仍未阐述清晰。

奶牛助产是牧场处理难产的常用手段，但助产增加子宫、生殖道的损伤及微生物的污染，导致母牛受胎率降低、冻精使用量增加、空怀时间增加和首次配种时间后移等繁殖问题[15-16]，闫明涛[19]发现难产级别和产后疾病的发病率呈现正相关，且产后疾病对21 d怀孕率影响显著，辅助分娩的奶牛更容易感染坏死梭状芽胞杆菌和化脓性链球菌[20-21]。在本研究中，作者以助产和非助产奶牛为研究对象，分离培养母牛分娩45 d后的子宫灌洗液。结果表明，非助产奶牛分离出链霉菌属、链球菌属、肠杆菌属、葡萄球菌属、气球菌属等5个属的细菌，助产奶牛分离出志贺氏菌属、不动杆菌属、假单胞菌属、棒状杆菌属、芽胞杆菌属、链球菌属、肠杆菌属、葡萄球菌属、气球菌属等9个属的细菌。在种的水平上，助产组奶牛增加了宋内氏志贺菌、不动杆菌、绿色气球菌、摩氏假单胞菌、银色棒状杆菌、地衣芽胞杆菌和表皮葡萄球菌。助产组奶牛子宫内微生物多样性明显多于非助产组。但据文献估计，实验室中可培养的细菌不到1%[22]，因此推断实际的助产组奶牛子宫中生物多样性更加显著。人们普遍认为健康动物的子宫在妊娠期间处于无菌状态，而产后子宫极易受到细菌的污染[23]。这主要是由于产中及产后阴门、阴道和子宫颈口的扩张，利于细菌的入侵，加之产后初期子宫内营养物和温度适合细菌的生长，为侵入细菌的繁殖提供了适宜的条件。正常情况下，机体依靠自身的防御机能，能够将子宫内的污染自动清除；
如果机体自身体质弱、防御系统不健全，特别是助产引起生殖道损伤及污染，造成致病菌净化困难，致使病原菌的大量繁殖。在难产引起的损失中，因繁殖问题引起的损失占比达30%[24]。助产导致严重的繁殖问题，主要是由于助产造成损伤及子宫内菌群多样性增多，引起子宫内膜组织复旧时间延长等。此外，细菌产物或炎症产物可抑制垂体促黄体素的分泌，干扰产后卵巢的功能和卵泡的生长，中断排卵，从而影响卵巢排卵的正常周期[24]。因此提示，助产造成的子宫微生物多样性增加，导致其产物引起生殖激素分泌失衡、子宫内膜及卵巢功能紊乱，致使奶牛妊娠率降低，配种次数增加等问题[25]。

综上所述，助产和非助产奶牛子宫菌群差异显著，助产导致子宫内菌群多样性增加。产后子宫内持续性的细菌存在，是造成助产奶牛繁殖问题的原因之一，而其中的机制还需进一步探索。

助产能够造成奶牛产后子宫内长时间的菌群多样性增加。

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