陈江平，甘力帆，罗宇琴，钟文峰，马永富，魏梅

广东一方制药有限公司/广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244

白芷为伞形科植物白芷Angelica dahurica（Fisch.ex Hoffm.）Benth.et Hook.f.或杭白芷Angelica dahurica（Fisch.ex Hoffm.）Benth.et Hook.f.var.formosana（Boiss.）Shan et Yuan的干燥根，具有解表散寒、祛风止痛、宣通鼻窍、燥湿止带、消肿排脓的功效，临床主要用于感冒头痛、眉棱骨痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻渊、牙痛、带下、疮疡肿痛等［1］。现代研究表明，白芷主要含有挥发油类、香豆素类、微量元素、多糖、黄酮类、生物碱类等多种成分［2］，其中香豆素类成分欧前胡素具有抗炎、镇痛、镇静等药理作用［3-6］。2015年版《中华人民共和国药典》一部白芷项下以欧前胡素含量作为白芷药材的质量控制指标［1］。

白芷配方颗粒为白芷饮片经水提、浓缩、干燥、制粒而成，具有免煎煮、携带方便、易服用、易储存等优点，近年来，中药配方颗粒得到越来越多的医生和患者的选择［7］。文献研究表明［8-10］白芷的功效与其含有的挥发油、香豆素类成分密不可分，而很多成分如欧前胡素、异欧前胡素、白当归素、氧化前胡素等均有文献报道遇热不稳定［11-12］，所以有必要对白芷配方颗粒建立全面的质量控制方法。本研究建立了白芷配方颗粒欧前胡素含量测定方法和UPLC特征图谱测定方法，可为白芷配方颗粒质量标准的制定提供参考。

1.1 仪器Waters H-class超高效液相色谱仪及Waters e2695高效液相色谱仪（美国Waters仪器公司）；
ME204E万分之一天平及XP26百万分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；
KQ-500DE数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；
Milli-Q Direct超纯水机（德国默克股份有限公司）。

1.2 试剂与试药欧前胡素对照品（批号：110826-201616，含量：99.6%）、异欧前胡素对照品（批号：110827-201611，含量：99.4%）均购自中国食品药品检定研究院；
白当归素（批号：wkq16031401，含量：98.0%）购自四川维克奇生物科技有限公司。甲醇、乙腈、乙酸均为色谱纯，购自德国默克股份有限公司；
水为超纯水；
其他试剂均为分析纯。18批白芷配方颗粒由广东一方制药有限公司提供，编号为S1～S18。

2.1 欧前胡素含量测定

2.1.1 色谱条件色谱柱：Agilent ZORBAX SB C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；
流动相：甲醇-水（55∶45）；
检测波长：300 nm；
流速：1.0 mL/min；
柱温：30℃；
进样量：10 μL。

2.1.2 对照品溶液制备取欧前胡素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含59.8990 μg的欧前胡素对照品溶液，备用。

2.1.3 供试品溶液制备取白芷配方颗粒适量，研细，取约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇20 mL，称定重量，超声处理（功率300 W，频率50 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 专属性考察取对照品溶液、供试品溶液和空白溶剂适量，照“2.1.1”项下色谱条件测定，结果表明该方法专属性良好。见图1。

图1 白芷配方颗粒HPLC色谱图

2.1.5 线性关系考察分别精密量取浓度为59.8990 μg/mL的对照品溶液0.25、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 mL置于10 mL量瓶中，分别加甲醇定容制成每1 mL含1.4974、2.9950、5.9899、14.9748、29.9495、59.8990 μg的对照品溶液，照“2.1.1”项下色谱条件测定，以对照品浓度（μg/mL）为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得欧前胡素线性回归方程：Y=25615.8274X+4409.6677（r2=0.9999），表明欧前胡素浓度在1.4948～59.8990 μg/mL范围内线性关系良好。

2.1.6 精密度考察取浓度为5.9899 μg/mL的对照品溶液适量，按照“2.1.1”项下色谱条件重复进样6次，计算欧前胡素峰面积的RSD为0.55%，表明仪器精密度良好。

2.1.7 稳定性试验取白芷配方颗粒（S2）样品适量，照“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，照“2.1.1”项下色谱条件分别在0、3、6、9、12、24 h进样测定，计算欧前胡素峰面积的RSD为2.72%，表明供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.1.8 重复性试验取白芷配方颗粒（S2）样品适量，照“2.1.3”项下方法制备供试品溶液6份，照“2.1.1”项下色谱条件测定，计算欧前胡素含量的RSD为1.52%，表明该方法重复性良好。

2.1.9 加样回收率试验取已知含量的白芷配方颗粒（S2）样品适量，研细，精密称取9份，每份约0.2 g，置于具塞锥形瓶中，分为3组，每组分别加入相当于含量50%、100%、150%的欧前胡素对照品溶液，照“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，照“2.1.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率及RSD值，结果见表1。

表1 欧前胡素加样回收率试验结果（n=9）

2.1.10 样品检测取白芷配方颗粒（S1～S18）样品，照“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，照“2.1.1”项下色谱条件测定，结果见表2。

表2 18批白芷配方颗粒样品中欧前胡素含量（n=3） mg/g

2.2 UPLC特征图谱建立相关试验

2.2.1 色谱条件色谱柱：Agilent SB C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；
流动相：以乙腈为流动相A，以0.1%乙酸溶液为流动相B，梯度洗脱（0～5.5 min，15%～28%A；
5.5～7.0 min，28%～40%A；
7.0～9.5 min，40%A；
9.5～15.5 min，40%～65%A；
15.5～15.51 min，65%～15%A；
15.51～18.00 min，15%A）；
检测波长：300 nm；
流速：0.35 mL/min；
柱温：35℃；
进样量：1 μL。

2.2.2 对照品溶液制备取欧前胡素、异欧前胡素、白当归素对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1 mL含欧前胡素10.001 μg、异欧前胡素1.835 μg、白当归素14.020 μg的对照品溶液，备用。

2.2.3 供试品溶液制备取白芷配方颗粒适量，研细，取约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，超声处理（功率300 W，频率50 kHz）20 min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 精密度试验取白芷配方颗粒（S2）样品适量，按照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，照“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，以4号峰欧前胡素为参照峰，计算得各特征峰相对保留时间和相对峰面积的RSD范围分别为0.02%～0.09%、0.15%～0.80%，表明仪器精密度良好。

2.2.5 重复性试验取白芷配方颗粒（S2）样品适量，按照“2.2.3”项下方法制备6份供试品溶液，按照“2.2.1”项下色谱条件测定，以4号峰欧前胡素为参照峰，计算得各特征峰相对保留时间和相对峰面积的RSD范围分别为0.02%～0.15%、0.10%～0.50%，表明该方法重复性良好。

2.2.6 稳定性试验取白芷配方颗粒（S2）样品适量，按照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按照“2.2.1”项下色谱条件分别在0、3、6、9、12、24 h进样测定，以4号峰欧前胡素为参照峰，计算得各特征峰相对保留时间和相对峰面积的RSD范围分别为0.02%～0.12%、0.08%～0.50%，表明供试品溶液在24 h内较稳定。

2.2.7 特征图谱的建立取白芷配方颗粒（S1～S18）样品，按照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按照“2.2.1”项下色谱条件测定得到18批白芷配方颗粒UPLC特征图谱，以4号峰欧前胡素为参照峰，各特征峰的相对保留时间和相对峰面积见表3—4。确定了6个共有峰，与对照品对比确定2号峰为白当归素，4号峰为欧前胡素，6号峰为异欧前胡素，见图2。

图2 白芷配方颗粒U P LC色谱图

表3 18批白芷配方颗粒共有峰相对保留时间

2.2.8 特征图谱相似度评价将18批白芷配方颗粒的特征图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”软件，生成白芷配方颗粒共有对照特征图谱，相似度评价结果见图3、表5。

表5 18批白芷配方颗粒特征图谱相似度

图3 18批白芷配方颗粒的UPLC特征图谱

表4 18批白芷配方颗粒共有峰相对峰面积

本研究在白芷配方颗粒欧前胡素含量测定方法建立过程中考察了甲醇、50%甲醇、稀乙醇和乙醇4种溶剂对欧前胡素含量的影响，结果表明甲醇、50%甲醇和稀乙醇的提取效果均较好，综合考虑，选择稀乙醇作为白芷配方颗粒欧前胡素含量测定的提取溶剂。也考察了不同提取方法（超声、水浴回流）、不同溶剂体积（10、20、50、100 mL）和不同提取时间（15、30、40 min）对欧前胡素含量的影响，结果表明超声提取方法优于水浴回流提取方法，溶剂体积和提取时间对欧前胡素的含量无显著影响。因此，选择加入20 mL稀乙醇超声处理30 min作为供试品溶液的制备方法。本研究结果表明18批白芷配方颗粒的欧前胡素含量范围为0.411～0.846 mg/g，较为稳定，这与原药材质量和生产工艺稳定相关。

文献表明，白芷总香豆素类成分与总挥发油类成分合用，具有明显协同作用，在减轻炎症和疼痛方面的药理作用强于单一成分［8］。因此，仅控制白芷配方颗粒中单一成分的含量不能全面反映白芷配方颗粒的质量情况。特征图谱可较全面反映中药制剂中所含主要成分与种类，从而达到对制剂整体质量进行控制的目的。本研究采用UPLC法建立了白芷配方颗粒特征图谱，确定了6个共有峰，18批白芷配方颗粒样品的相似度均大于0.9，说明样品之间质量差异小，较稳定。可见，本研究建立的白芷配方颗粒欧前胡素含量测定方法及UPLC特征图谱测定方法可较好地用于白芷配方颗粒的质量控制与评价。

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