王恺悦，王增勇，范新蕾，张照勇，杨永芳

（1临沂市人民医院；
2山东医学高等专科学校，山东 临沂 276000）

脑肿瘤（Brain tumor, BT）在恶性肿瘤发病中具有高度异质性和高死亡率的特点[1], 2016年全球有330,000例中枢神经系统癌症和227,000例死亡病例，1990—2016年全球中枢神经系统癌症的年龄标准化发病率增加了 17.3%[2]，恶性BT大约占30.2%，其中高级别胶质瘤是最常见的类型，占50%以上[3]。现有的治疗方法，很难在胶质瘤中获益[4]。山东中医药大学附属医院神经外科姜汝明教授等在脏腑辨证的基础上加蛇枝黄苓汤（Shezhihuangling decoction, SZHL），发现其具有抑制术后肿瘤生长、延缓病情发展、改善放化疗所产生的不良反应等作用[5]。方中白花蛇舌草和半枝莲为君药，土茯苓为臣药，黄芪、当归、大黄、黄连、白术为佐药，葛根为引经药，共奏补肾祛浊、散瘀解毒之效[6]。现代药理学研究发现，白花蛇舌草提取物通过细胞外调节蛋白激酶通路诱导U87细胞的线粒体凋亡[7]，半枝莲提取物野黄芩苷通过抑制磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白通路抑制U251细胞株的增殖、迁徙和侵袭作用[8]，木犀草素通过激活丝裂原活化蛋白激酶通路、抑制miR-124-3p的表达来抑制胶质瘤细胞增殖、促进自噬和诱导凋亡[9]，其甲氧基聚乙二醇-聚ε-己内酯纳米胶束在体内和体外均被证实有良好的生物利用度和细胞毒性[10]。虽然方剂中的多种中药提取物和单体成分抗胶质瘤的作用已经明晰，但是复方中的多化合物-多靶点-多通路的药理机制尚不明确，阻碍了其在临床中的进一步推广。本研究使用网络药理学的方法，首先筛选了SZHL抗脑肿瘤潜在的分子机制和靶点，揭示方剂-成分-靶标-疾病之间复杂的网络关系[11]，然后应用分子对接的方法进行验证，预测药物的药理学潜在机制，以期揭示中药复方的科学内涵、传承和发展中医药理论。

1.1 筛选SZHL中药活性成分 在中药系统药理学数据库及分析平台（TCMSP）中分别以SZHL中9味中药为关键词，以口服生物利用度（Oral Bioavailability, OB）≥30%、药物相似性（Druglike Properties，DL）≥0.18为筛选标准，提取各中药的活性成分。根据其透过血脑屏障（Blood Brain Barrier，BBB）的能力，将BBB≥0.30的活性成分定义为中枢成分，共筛选出31种化合物；
将BBB ＜ 0.30 定义为外周成分，共得到75种化合物。

1.2 确定各活性成分的生物学靶标 将上述活性成分导入DrugBank数据库以获取其作用的靶点。在中枢成分中共鉴定出633个靶点，其中HDH 71个，AMK 22个，SBH 110个，RRER 49个，ASR 69个，RP 38个，CR 87个，HMM 115个，SGR 72个；
周围成分中共确定165个靶点：HDH 185个，AMK 1个，SBH 482个，RRER 60个，ASR 64个，RP 59个，CR 200个，HMM 347个，SGR 253个。去除重复后，最终筛选出中枢成分中的347个靶点和外周成分中的996个靶点。

1.3 筛选脑肿瘤的差异表达基因 在GEO数据库挖掘BT相关的差异表达基因数据（Series：GSE50161，Samples：GPL570），样品分布：室管膜46个，胶质母细胞瘤34个，髓母细胞瘤22个，毛细胞星形细胞瘤15个，正常样品13个。筛选P-value ＜ 0.005和|log 2(fold change)| ＞ 1的基因确定为显著差异的基因用于后续的分析。

1.4 构建SZHL-脑肿瘤靶标网络 将SZHL活性成分及其靶标、BT差异表达的基因输入Cytoscape 3.8.0软件，分别构建了中枢成分-BT、周围成分-BT的网络并可视化。分别将中枢成分-BT靶点和周围成分-BT靶点投入到String数据库，筛选符合最高信度0.90的节点，创建初始PPI网络；
使用Cytoscape 3.8.0应用CytoNCA程序分析网络中每个节点的拓扑参数，将度中心性（Degree, DC）、间接中心性（Betweenness,BC）、紧密中心性（Closeness, CC）、特征向量中心性（Eigenvector，EC）作为关键因素，提取网络中最有效的节点。

1.5 GO和KEGG富集分析 运用Strawberry Perl(*64 3.6.2)程序，进行基因本体论（GO）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析 ，筛选符合P＜0.05，P＜0.05条件的前20个GO功能类别和信号通路进行后续分析；
使用 Cytoscape 3.8.0软件构建和可视化关键基因-信号通路网络。

1.6 分子对接 将PPI网络拓扑分析得到的有效节点设定为大分子受体，使用蛋白质结构数据库查找其3D结构，使用Pymol软件删除水分子及小分子配体；
将有效节点对应的活性成分为小分子配体，应用有机小分子生物活性数据库查找其2D结构，使用Chem3D 19.0软件构建其3D结构；
使用Autodock 4.2.6软件书写受体和配体的PDBQT文件并确定大分子蛋白的活性口袋；
使用Vina软件进行分子对接，选取对接结合能最低的结果为最佳对接模型；
使用Pymol软件可视化对接结果。

2.1 SZHL-BT靶标网络分析 根据BT组和正常组差异基因表达的情况，构建了热图和火山图（图 1）。表1显示根据成分-靶点网络中成分的度数筛选的Top10中枢成分和外周成分。中枢成分-BT靶点网络（图2A）由 30 个节点和58个边组成：β-谷甾醇和豆甾醇均为膳食植物甾醇成分，是影响脑肿瘤靶标数量最多的化合物，且存在于多种中药（HDH、SBH、RRER、ASR、RP和SGR）中；
此外，常春藤皂苷元、7-O-甲基异微凸剑叶莎醇均为 HMM 中的活性成分，作用于较多的靶标；
靶标节点中前列腺素内过氧化物合酶（PTGS2）、胆碱能受体3（CHRM3）、胆碱能受体1（CHRM1）、盐皮质激素受体（NR3C2）和胱天蛋白酶8（CASP8）的度数最高（图2A）；
以上结果显示上述活性成分及靶标处于网络中的枢纽位置。外周成分-BT靶标的网络包括 68个节点和174个边（图 2B）：多种中药（HDH、SBH、CR、HMM和SGR）中的槲皮素、SBH中的木犀草素和HMM中的山奈酚、为复方中的核心药效成分；
PTGS2、周期检测点激酶1（CHEK1）、周期蛋白依赖性激酶（CDK2）、γ 氨基丁酸A 受体（GABRA1）、p65基因（RELA）和细胞周期蛋白A2（CCNA2）的度数最高，为核心成分作用的关键靶点（图2B）。2.2 PPI网络及拓扑分析 将中枢成分-BT靶点进行PPI网络分析，蛋白激酶Cα（PRKCA）、PTGS2、CDK2、CASP8处于 网络的 核心（图3A）；
如图3B所示，周围成分-BT靶标构成的PPI网络由66个节点和471条边组成，经过筛选得到的终网络中，VEGFA、PTGS2、IL1B、CCND1、MMP9为度数最高的节点，提示处于网络的核心。

图1 脑肿瘤差异表达基因热图和火山图

图2A SZHL中枢成分-脑肿瘤靶点网络图可视化图

图2B SZHL周围成分-脑肿瘤靶点网络可视化图

图3A SZHL治疗脑肿瘤中枢靶点PPI网络图

图3B SZHL治疗周围靶点PPI网络图

表1 SZHL的中枢活性成分和外周成分（Top 10）

2.3 GO富集分析 图4A为SZHL的中枢成分作用于BT前10位的GO富集结果，主要涉及的G蛋白偶联受体信号通路、血管调节、突触后膜神经递质调节等功能。图4B展示了SZHL外周成分-BT靶标前10位GO富集结果，主要涉及的功能有：细胞对脂多糖的反应、有丝分裂细胞周期 G1/S 转换的负调控等。

图4B SZHL周围靶点的GO富集分析条形图和圈图

图4A SZHL中枢靶点的GO富集分析条形

2.4 核心靶点-信号通路网络分析 如图5所示，中枢成分核心靶点-信号通路网络共有35个节点和65条边，外周成分靶点-通路网络由66个节点和241条边组成。中枢网络中度数最高的靶点PRKCA和外周网络中的B 细胞κ轻肽基因增强子抑制因子（IKBKB）、RELA、CCND1、丝裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）、血管内皮生长因子A（VEGFA）是连接最多信号通路的靶点。中枢通路中的逆行大麻素受体信号通路、cAMP信号通路，周围通路中的TNF信号通路、IL-17信号通路、NF-kB等信号通路，处于网络中的核心位置。

图5 SZHL治疗脑肿瘤中枢靶点（5A）及周围靶点（5B）与信号通路网络可视化图

2.5 分子对接 如表2所示，根据药效成分-靶点网络选取节点和度数最高的药效成分与PPI网络筛选的核心蛋白进行分子对接，共获得26组配体-受体对接结果，中枢成分10组（图6A），周围成分16组（图6B）；
所有的药效成分与基因靶点的对接结合能均＜0 kcal·mol-1，提示两者可以自发进行结合；
24组分子对接结合能均小于-7.0kcal·mol-1，提示两者有强烈的对接能力。

图6 SZHL治疗脑肿瘤中枢成分（6A）及周围成分（6B）与靶点分子对接结果可视化图

表2 SZHL药效成分与关键靶点对接结果

中医药治疗脑肿瘤从整体出发，遵循扶正与驱邪结合、辨证与辨病结合，多数医家认为，脑肿瘤病位虽在脑，但与肝、脾、肾密切相关。姜汝明等[6]对75例胶质瘤术后患者在脏腑辨证的基础上服用SZHL，发现治疗组影像学有效率明显高于对照组，而影像复发率低于对照组，此外，治疗组血清肿瘤标志物和炎性指标、全身不良反应（呕吐、纳差、脱发等）明显低于对照组，由此可见，SZHL的药效成分同时从中枢和周围发挥作用。在脑肿瘤的化疗中，血脑屏障对化疗药物的反应和耐药性密切相关，血脑屏障由以紧密连接为特征的内皮细胞组成，超过98%的小分子化合物不能穿过这个屏障[12]。因此，我们通过常规的对药效成分进行筛选（OB≥30%、DL≥0.18）的基础上，将是否能够透过血脑屏障（BBB ≥ 30% 和 BBB＜30%）作为重要指标，分别从中枢机制和周围机制出发，分别探讨SZHL抗脑肿瘤的机制。

3.1 SZHL中枢成分的抗脑肿瘤机制 中枢成分中，β-谷甾醇和豆甾醇是与胆固醇相似的常见的植物甾醇（PS）[13]。体内和体外研究显示PS具有多种抗肿瘤特性，包括抑制凋亡、抗炎、抗血管生成和迁移、阻滞细胞周期等[14]。临床试验和荟萃分析证实，高 PS 摄入量与多种癌症的发病风险呈负相关[15-16]。PS可以透过血脑屏障，调节胆固醇代谢[17]，但其透过血脑屏障的机制尚不明确，高密度脂蛋白（HDL）、载脂蛋白E和 B 类Ⅰ型清道夫受体可能发挥重要作用[18]。ABC转运蛋白是一种分布于星形胶质细胞和大脑内皮基底外侧的跨膜蛋白，PS可以通过ABC转运蛋白在颅脑中释放，随后被 HDL样颗粒吸收[19]。

中枢成分-疾病靶点网络及PPI网络表明，PRKCA、PTGS2、CDK2、CASP8等是重要的靶标，分子对接显示上述靶标与相应药效成分有强烈的结合能力，通过这些分子，筛选出SZHL主要通过逆行大麻素受体信号通路、cAMP信号通路等发挥调节G蛋白偶联受体信号转导、血管调节、突触后膜神经递质调节等生物功能。G蛋白偶联受体（GPCR）参与调节神经胶质瘤的生长、迁移和血管生成[20]。大麻素受体可以激活GPCR，通过增强CCND和CDK抑制基因的转录促进神经胶质瘤细胞增殖；
Gαi和 Gαs亚基调节腺苷酸环化酶（cAMP）水平以激活蛋白激酶A（PKA），而Gαq/11 促进PKC激活NF-kB[21]。PRKCA编码蛋白激酶Cα（PKCα)，它是参与肿瘤形成和进展的钙和磷脂依赖性丝氨酸/苏氨酸激酶家族的成员[22]；
一项队列研究显示，16例脊索样胶质瘤患者中有14例患者携带PRKCA D463H突变，2例患者合并携带BRAFV600E突变[23]；
突变体 PRKCA的表达引起磷酸化ERK 增加和锚定非依赖性生长，导致脊索样胶质瘤异常增殖。

3.2 SZHL外周成分抗脑肿瘤的机制 在外周机制中，槲皮素、木犀草素、山奈酚等是重要的药效成分，通过影响VEGFA、PTGS2、IL1B、CCND1、MMP9等靶点发挥抗脑肿瘤的作用，分子对接证实上述药效成分和靶点有强烈的结合能力。槲皮素通过破坏和减少线粒体和粗面内质网的表面丝状伪足样结构和基质金属蛋白酶2的表达、增加纤连蛋白和层粘连蛋白的表达水平来影响胶质瘤细胞的迁移[24]。用槲皮素预处理小胶质细胞和C6细胞可通过促进IL-1β、IL-6和IL-18 mRNA的表达，以及抑制一氧化氮合酶（NOS2）、PTGS2、TGF-β、胰岛素样生长因子（IGF）的mRNA表达来发挥抗炎和抗肿瘤作用[25]，与本研究的结果一致。纳米技术、热疗技术、受体介导的转运等创新技术，可以发挥增强药物对血脑屏障的通透性，增加颅内药物的浓度等作用[26]，是目前抗肿瘤药物研究的热点。载有山奈酚的黏膜粘附纳米乳剂显著增加了进入大鼠大脑的药物量，并在鼻腔给药后诱导C6神经胶质瘤细胞的凋亡[27]，这些研究促进了脑肿瘤治疗新药和治疗策略的开发。

GO和KEGG结果，外周成分-脑肿瘤涉及的靶标主要发挥细胞对脂多糖的反应、有丝分裂细胞周期 G1/S 转换的负调控等生物功能，主要通过TNF信号通路、IL-17信号通路、NF-kB等信号通路发挥作用。从G细菌细胞壁释放的脂多糖（LPS）已被证实是肠道炎症的重要促进因素[28]。LPS 通过与细胞表面的Toll样受体（TLR-4）复合物结合，触发了多个细胞内信号过程，尤其是NF-kB蛋白酶抑制剂IKK-α的磷酸化[29]。研究表明，肠上皮紧密连接屏障的缺乏与肠道和全身炎症的发展显示相关[30]。肠道炎症与癌症之间有密切的关系，促炎细胞因子的分泌可诱导结肠癌小鼠模型中的肿瘤生长[31]。在果蝇幼虫中，与正常个体相比，癌性幼虫的芽孢杆菌科的相对丰度显著降低，这表明脑肿瘤的发展可能与肠道微生物群落组成的改变有关[32]，这种分子机制可能为进一步研究肠道炎症与 BT 肿瘤发生之间的关系提供证据。

本研究创新性从中枢机制和外周机制分别出发，在前辈临床实践的基础上，利用网络药理学的手段，探索了SZHL治疗脑肿瘤的分子机制：SZHL中的植物甾醇、常春藤皂苷元等成分具有透过血脑屏障的能力，发挥影响胆碱能细胞信号转导、诱导细胞凋亡等作用；
槲皮素、山奈酚、木犀草素等周围成分，通过抗炎、调节免疫等机制发挥抗脑肿瘤的作用。

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