孟玲宁 曹小利 张燕 周万青 沈瀚

(南京大学医学院附属鼓楼医院检验科，南京 221000)

细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)是一种细胞分泌的膜性囊泡。研究表明EVs在细胞生命的许多方面起着重要作用，包括细胞间的通讯、发病机制和癌症进展[1]。然而，EVs在微生物学中的作用却研究较少，EVs在微生物中最先是在革兰氏阴性菌中发现的[2]，后续的研究表明它们在革兰氏阳性菌中也普遍存在[3]，此后也有研究发现其在病毒致病过程中的作用和机制。目前，关于EVs与真菌感染关系的研究甚少，本综述将介绍EVs在真菌中的相关研究进展。

在真核细胞中，EVs共分为四种类型：第一种称为凋亡小体，它是胞膜皱缩内陷形成的泡状小体，其大小在1 000～5 000 nm；
第二种称为细胞微泡，它是由细胞膜上出芽后向外分泌而成，其大小为100～1 000 nm；
第三种称为膜粒子，它是由上皮细胞分泌的特有的囊泡物质，其大小为50～80 nm；
第四种称为外泌体，它是细胞早期内腔内陷和向内发芽而形成的囊泡，后与细胞膜融合释放出细胞的膜性囊泡，其大小为40～100 nm[4]。现有文献中提到的EVs均没有严格区分真菌中的凋亡小体、细胞微泡以及外泌体，统称为细胞外囊泡。EVs内部或表面上携带各种蛋白质、核酸、碳水化合物、毒素、色素和其他分子[5]。

与其他原核微生物不同，真菌EVs在大分子的跨细胞壁分泌中起到重要作用，它能够保护内部成分免受跨细胞壁过程中的降解并确保其有效浓度。但目前没有明确的机制阐明EVs是如何穿过真菌细胞壁进入外部环境中，只有三种假说：一是在细胞膜和细胞壁之间聚集的EVs会产生膨胀压力，从而迫使EVs穿过细胞壁，在这种情况下，EVs的大小将由细胞壁的孔径大小或细胞壁的厚度决定；
二是由EVs相关的降解酶及合成酶介导的细胞壁重塑，使得EVs穿过细胞壁进入外部环境；
三是涉及细胞壁的跨蛋白质通道，可以促进EVs的通过，这一过程可能需要能量参与[6-7]。

2.1 隐球菌属

新生隐球菌是第一种分离出EVs的真菌，EVs中携带了蛋白、脂类、RNA和许多毒力因子包括荚膜抗原、葡萄糖醛酸氧甘露聚糖(GXM)、漆酶等[8]。脂质分析显示，新生隐球菌EVs中除了包括葡萄糖神经酰胺和麦角固醇外，还存在磷脂酰胆碱和其他磷脂[9]。另两项关于新生隐球菌蛋白质组学的研究分别发现了其EVs中有92种和202种蛋白，其中包括了具有细胞毒性以及应对氧化应激功能的蛋白质[10]。EVs中也存在着不同类型的RNA，主要包括miRNA、非编码RNA(ncRNA)以及mRNA[11]。

有研究表明新生隐球菌EVs能够穿过细胞壁进入荚膜是在细胞壁重塑酶介导下，敲除几丁质主要合成酶基因CHS3或者次要合成酶基因CHS2、CHS6以及CHS7，在很大程度上会减少EVs的释放以及细胞外GXM的含量。相反，如果敲除基因CHS4或者CHS5则可以增加EVs的产生。CHS相关基因的敲除对EVs释放产生的不同影响提示真菌细胞壁的结构会直接影响到EVs的生物学特性[12]。EVs中的GXM对巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和T淋巴细胞具有免疫抑制作用，有研究表明，因为Fas/FasL通路的激活，GXM在体内外均表现出对巨噬细胞的细胞毒功能。同时，又有研究证实了在体外实验中新生隐球菌EVs刺激的巨噬细胞会产生相关的细胞因子包括TNF-α和NO，而这些因子的产生会增加巨噬细胞吞噬和杀死真菌细胞的能力，这些研究表明新生隐球菌产生的EVs对真菌致病产生了正调控和负调控的双功能[13-14]。

格特隐球菌同样可以释放EVs以调节巨噬细胞反应，它们通过释放EVs向邻近的真菌细胞发出信号，使其在巨噬细胞内迅速增殖，而EVs这种提高格特隐球菌细胞增殖速率的能力则取决于其内部的特异性蛋白及RNA[15]。

2.2 念珠菌属

白念珠菌是最常见的人类共生真菌，其主要定植于健康个体的胃肠道、口腔和阴道黏膜。在免疫抑制个体中，白念珠菌则会成为机会致病菌引起一系列疾病，从浅表的黏膜感染到危及生命的全身感染。大多数情况下，白念珠菌是以酵母相和菌丝体的形式存在，而关于白念珠菌EVs的研究大多集中在酵母相上[16]。白念珠菌EVs蛋白质组学研究将EVs中发现的75种蛋白质分为9个功能组，其中最多的是与细胞壁相关的蛋白质，占41%[17]。研究发现白念珠菌EVs中的脂质成分基本与新生隐球菌中的相似，包括磷脂酰丝氨酸、葡萄糖基神经酰胺和麦角固醇。白念珠菌EVs中同样有和新生隐球菌类似的miRNA、ncRNA和mRNA[18]。

研究表明磷脂酰丝氨酸在免疫细胞的激活过程中起到重要作用，敲除磷脂酰丝氨酸合酶基因CHO的白念珠菌EVs不能够激活巨噬细胞BMDM和J774.14中NF-κB[19]。研究数据表明，白念珠菌EVs具有免疫调节功能，可以促进先天性免疫反应的激活，其EVs可以刺激巨噬细胞RAW264.7产生NO和IL-12，并且降低IL-10和TGF-β；
同时也可以刺激巨噬细胞BMDM产生NO、IL-12及TNF-α[20]。由于白念珠菌EVs中存在有特定的葡萄糖跨膜转运蛋白Hgt1p，所以与其他真菌EVs相比，白念珠菌产生的EVs在人血清中能够更稳定存在，原因是该转运蛋白与补体因子H相结合，从而逃避补体替代途径的活化[19]。

KARKOWSKA-KULETA等[21]在2020年首次分离出了光滑念珠菌、热带念珠菌以及近平滑念珠菌中的EVs，通过纳米颗粒跟踪分析及透射电镜分析，发现其大小与白念珠菌EVs相似，多为50～100 nm及200 nm以上。质谱结果显示这些念珠菌EVs存在大量有关真菌细胞壁构建、重塑及完整性的蛋白，3种念珠菌EVs中均存在细胞壁葡聚糖酶(包括Eng1、Exg1、Xog1、Bgl2和Scw4)，这些酶的活性与EVs穿过细胞壁到达外部环境相关，同时在表面多糖的重塑过程中发挥作用，使得真菌能够通过干扰受体识别影响其与宿主免疫细胞的相互作用。

2.3 其他真菌

副球孢子菌病是一种系统性肉芽肿性真菌病，多见于拉丁美洲地区，该病由巴西副球孢子菌引起，它是一种双相型真菌[22]，通过电子显微镜分析显示EVs大多为20～200 nm。其EVs中鉴定出了具有免疫原性的α-Gal抗原决定簇，在酶联免疫吸附测定中，含有α-Gal表位的巴西副球孢子菌EVs与副球菌类真菌病患者分离的抗α-Gal抗体以及MOA(识别末端α-Gal的凝聚素)发生特异性反应，用半乳糖苷酶处理后反应被抑制[23]。有研究表明，巴西副球孢子菌可以诱导小鼠巨噬细胞产生促炎分子从而调节宿主免疫[24]。

马拉色菌是人类皮肤菌群中的主要共生真菌，与特应性皮炎等皮肤病有一定关系。Gehrmann等[25]证实了马拉色菌会释放具有免疫调节功能的细胞外囊泡，这些EVs在PBMC(peripheral blood mononuclear cells,外周血单核细胞)中可以诱导IL-4和TNF-α应答，与健康对照组相比，特应性皮炎患者IL-4的产生明显更高。

荚膜组织胞浆菌是一种双相型真菌，多为一过性感染，但在免疫缺陷或低下的患者中可引起播散性组织胞浆病，预后凶险。研究表明，荚膜组织胞浆菌可以利用EVs的分泌机制运输毒力因子，并且其EVs与组织胞浆病患者的血清可以发生免疫反应，证明EVs成分与发病机理相关[26]。

细胞外囊泡的富集和分离对于其后续的成分和功能研究非常重要，基于外泌体的尺寸、密度和免疫表型发展出了多种提取方法，包括超速离心法、密度梯度离心法、聚合物沉淀法、超滤法、体积排阻色谱及免疫亲和法等[27]。由于目前真菌EVs的研究还处于初步阶段，所以其分离方法比较单一，最常用的分离真菌EVs的方法为超速离心法，将培养48 h的真菌上清液进行连续离心，首先低速离心去除细胞以及碎片，后高速离心去除大直径的囊泡。接着将上清液通过0.4～0.8 μm的碳聚酸脂膜过滤器后进行20倍浓缩，最后再使用更高速离心沉淀真菌EVs[28-29]。但这种传统的分离方法耗时久，并且产量很低，最主要的问题是这种方法是从液态培养基中分离得到的EVs，但生理状态下EVs并不是在液体基质中产生的，所以为了更好地模拟生理状态下EVs的生物学特性， REIS等[30]以格特隐球菌为模型，研究出一种从固体培养基中快速可靠分离出真菌EVs的新方法。将一定浊度的格特隐球菌悬浮液均匀接种于YPD固体培养基中，使得真菌EVs受平板尺寸的限制在生长区域中形成密度相对较高的囊泡，培养24 h后用接种环收集真菌细胞于PBS中制备成缓冲液，最后进行差速离心初步去除细胞和碎片，将所得上清液通过0.45 μm的脂膜过滤，最后高速离心获得EVs的沉淀。

目前，真菌细胞外囊泡的研究依旧处于起步阶段，得益于哺乳动物体系外泌体研究方法的快速发展，真菌EVs的分离方法也在不断改进。但真菌EVs特定生物标志物的缺乏阻碍了其进一步亚型的分类，在此后的研究中，真菌EVs可以根据ISEV的建议进行表面标记分类(CD63+、CD81-等)，而不是简单的大小分类。真菌EVs是免疫反应调节中的重要因素，其内部分子的多样性导致了不同的免疫应答，在某些情况下，EVs作用于免疫系统对宿主有益，而其他情况时，EVs又支持疾病的发生发展，这种差异可能取决于病原体本身及其EVs，为了进一步阐明这种机制，有必要进行更深入的研究。真菌EVs成分虽复杂，但是它们影响真菌与宿主细胞的相互作用表明，其在提供新的抗真菌感染策略中具有巨大的潜力；
真菌细胞外囊泡包括很多具有免疫原性的蛋白质和糖类，这也为其作为诊断标志物和疫苗研究提供了新思路。真菌EVs的结构与实验室被工程化的脂质体相似，在脂质体中携带病原相关分子模式PAMP(pathogen-associated molecular patterns)或损伤相关分子模式DAMP(damage associated molecular patterns)后可以促进佐剂样特性，结构相似的真菌EVs同样可以发挥脂质体的作用，为白细胞提供真菌PAMP，并可能促进CD4亚群的分化，证实了其作为疫苗的潜力。目前已有针对白念珠菌外泌体疫苗的研究，但其免疫反应性和毒性还需要进一步的证实。

猜你喜欢 细胞壁念珠菌球菌 烟曲霉相关基因、转录因子在其细胞壁重塑、稳态和生长定位中的作用中国真菌学杂志(2022年1期)2023-01-06肠球菌血流感染临床特征及预后危险因素分析中国感染与化疗杂志(2022年3期)2022-06-20论少见念珠菌在口腔念珠菌感染病例中的分布及其致病性首都食品与医药(2022年11期)2022-06-06宏基因组测序辅助诊断原发性肺隐球菌中国典型病例大全(2022年7期)2022-04-22广州地区生殖系统念珠菌病的菌型及其体外药敏结果分析国际医药卫生导报(2022年7期)2022-04-12血培养分离出212株念珠菌的菌种分布及耐药性分析中国真菌学杂志(2022年1期)2022-03-02植物初生细胞壁纤维素晶体结构新特征（2020.9.19 Plant Biotechnology Journal）三农资讯半月报(2020年18期)2020-10-14无菌部位的念珠菌属的分布特点及耐药性分析医药前沿(2020年4期)2020-04-27临床检验科普之你不知道的肠球菌特别健康·下半月(2019年7期)2019-07-29浅谈植物细胞壁的形成机制数码世界(2018年1期)2018-12-23