廖紫娟,郑 寓,杨光参,王艳伟

温州大学 数理学院,浙江 温州 325035

蛋白质在溶液中的复杂相互作用导致了不同的相行为,这对于理解蛋白质结晶的物理机制、蛋白质凝聚相关的疾病、细胞中的相变都是必不可少的。然而蛋白质在水溶液中的相互作用通常是复杂的,并取决于许多环境参数,包括浓度、盐离子价态、pH和温度。这些复杂的相互作用导致了非常丰富的相图,这对于我们理解蛋白质结晶[1-3]、蛋白质凝结相关疾病[4-6]以及细胞内细胞质的蛋白质液-液相分离(Liquid-liquid separation of proteins,LLPS)行为[7-9]至关重要。近年来,LLPS已被公认为是活细胞的基本组织原理,因此这一现象的作用机制和调控手段被广泛研究[10]。病理上,对于蛋白质而言,其溶液中的LLPS为白内障、镰状细胞性贫血和阿尔茨海默病的纤维形成提供了一种机制[6]。蛋白质凝聚性疾病中,发病的最初阶段是蛋白质的溶解性丧失,导致凝聚相的形成,例如:白内障中形成的致密液相、无定形聚集体或晶体,在这些现象中,蛋白质之间的吸引力是这些病理发生的驱动力。因此,表征蛋白质之间的相互作用是建立旨在抑制此类疾病策略的第一步[11]。在过去的几十年里,人们对这一领域的兴趣与日俱增,部分原因是在不同的软物质系统中观察到了同种电荷的吸引力[12-14]。理论研究和计算机模拟表明,多价离子的静电关联可以导致大离子聚集[15-19],预测了一个具有相分离区域的相图,即分子聚集在大离子的等电点周围,随后进行再稳定,并在进一步增加盐浓度时重新溶解,称为折入冷凝[18]。多组分液体混合物中的重入相变已被深入研究[20],蛋白质和DNA在多价反离子存在下的折入缩合现象是典型的例子。BSA作为模型蛋白已经成为了人血清白蛋白(HSA)的替代品并且被广泛运用,因此本研究将以BSA为研究对象,BSA是一种特殊类型的聚电解质,与DNA或传统的胶体体系不同,其正电荷和负电荷同时存在于表面,复杂的表面电荷模式与各种其他相互作用,如疏水相互作用和水合作用,使蛋白质溶液的相行为更加复杂,因此还没有找到对BSA的LLPS相行为的普遍描述。这一研究领域是物理学和生物学的交汇领域,尽管BSA的LLPS很重要,但我们对这一过程背后的物理机制的了解仍然有限。了解这些与蛋白质凝聚相关的现象(结晶、疾病和细胞中的相变)的机制很大程度上依赖于在不同条件下蛋白质相互作用的定量表征的进展。虽然生物化学的发展提供了有关蛋白质退化缩合效应的结构信息,但从了解结构到充分了解自组织过程的性质和机制仍有很长的路要走,全面了解调节蛋白质在溶液中的相互作用并改变其相行为的能力是取得进展的关键。

本课题致力于研究球状蛋白BSA的LLPS相行为,首先加入不同浓度YCl3会导致BSA溶液经历三个过程,我们关注中间阶段溶液变浑浊并分层的LLPS过程。接着改变BSA浓度通过大量实验观察记录并在光学倒置显微镜下对比验证了不同浓度BSA发生LLPS对应的临界YCl3浓度,且总结绘制了一个LLPS相图。最后通过动态光散射实验得出了BSA在LLPS过程中电泳迁移率随YCl3浓度的变化,通过对BSA表面电荷变化进行LLPS机制分析。

BSA纯度≥98%(产品编号:A1933),氯化钇(YCl3),纯度为99.99%(产品编号:A1933)。从Milliq系统中获得纯化水,没有使用缓冲液来避免其他离子的影响。BSA分子质量为66.5 kDa,等电点pI=4.6。

2.1 动态光散射装置

图1为动态光散射(Dynamic Light Scattering, DLS)原理图。其用途主要是检测散射光强度、频率(f) 以及时间(T)的变化。在检测过程中,当待测样品的测面受到光的直射时,会有散射光的产生。如果随着时间(T)的改变,散射光也会随之发生变化,那么我们就可以检测样品散射光的频率(f)和强度的变化,通过这两个参数测量出待测溶液中粒子的尺寸大小以及其表面的电荷量,因此,动态光散射(DLS)实验是一种用于测量粒子大小(即粒径),以及物质的Zeta电位(即电泳迁移率)的较好测量方法。利用动态光散射(DLS)实验进行检测的优点在于它的效率高、准确率高以及可重复利用性好。

图1 动态光散射原理图

其中Zeta电位又叫电动电位或电动电势,是指剪切面的电位,是表征胶体分散系稳定性的重要指标。由于分散粒子表面带有电荷而吸引周围的反号离子,这些反号离子在两相界面呈扩散状态分布而形成扩散双电层。当分散粒子在外电场的作用下,稳定层与扩散层发生相对移动时的滑动面即是剪切面,该处对远离界面的流体中的某点的电位称为Zeta电位,即Zeta电位是连续相与附着在分散粒子上的流体稳定层之间的电势差。而电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子,如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团,它们在某个特定的pH下可以带正电或负电,在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动,因此电泳迁移率是指在单位电场强度中带电分子的迁移速度。Zeta电位(ζ)与电泳迁移率(μ)满足关系式:

式(1)中ε为介质的介电常数,ζ为电势,η表示黏度系数。

2.2 光学倒置显微镜装置

光学倒置显微镜主要由机械、照明、光学三个部分组成,在结构方面与普通的显微镜类似,其原理如图2所示。光学倒置显微镜的几个主要部件及其功能:(1)光源的视场光阑(luminuos field diaphragm) 是一个重要的部件,能够根据使用的物镜倍数来调节大小。视场光阑的主要功能是:a.在成像光路系统中,控制杂色光的影响,尤其是杂散光对照相系统的干扰可以得到避免,这样可以防止显微照相底片蒙上一层灰雾。b.控制光束的大小,使光束能够均匀照到观察的视野。(2)机械移动式载物台(specimen stage)可以承载待测样品,装着能够在水平方向前后左右移动的调节装置,这样能够使待测样品更好的匹配显微照相的取景框。(3) 物镜(objectives)作为显微镜的核心光学部件,其分辨本领、像差和色差的校正状态和工作距离、放大倍数,这些参数都是通过调节物镜来决定的。(4) 目镜(eyepicecs)的作用是将所成像再放大一次,显微镜的放大倍数通常就是物镜放大倍数乘上目镜的放大倍数。(5) 粗、细准调焦旋钮(coaxial coarse/fine focusing controls)调焦时会导致燕尾导板上下移动从而达到移动舞台托架调焦的效果。

图2 光学倒置显微镜原理图

3.1 YCl3诱导BSA发生LLPS的过程

如图3所示,展示了依赖YCl3浓度变化,BSA进入LLPS与结束LLPS过程中的溶液直观现象。首先固定BSA质量浓度为100 mg/mL,随着YCl3浓度的增加,溶液体系会经历三个过程:第一个过程对应YCl3浓度小于8 mmol/L(图1(a)),样品溶液呈透明状,说明这个浓度范围的YCl3不足以引起BSA的LLPS。第二个过程对应YCl3浓度为8～20 mmol/L(图3(b)),样品溶液最初是浑浊的(左),静置15 min会出现分层的现象(中),取下层淡黄色溶液在光学倒置显微镜下观察,可以看到悬浮的小液滴(右),这些小液滴直径大小约为1～7 μm,通过观察发现这些小液滴可以合并增长,这一系列现象表明BSA处于LLPS状态。第三个过程对应YCl3浓度大于20 mmol/L(图3(c)),样品溶液恢复透明状态,标志着BSA的LLPS相行为结束。

(a)YCl3浓度小于8 mmol/L；
(b)YCl3浓度在8～20 mmol/L；
(c)YCl3浓度大于20 mmol/L。图3 YCl3诱导100 mg/mL BSA发生LLPS的过程

在实验中我们用纯水溶解BSA蛋白,而没有用缓冲液,是为了避免引入其他离子对实验的影响。而且我们也测量了在水溶液中不同浓度的BSA溶液的pH,如表1所示,发现BSA溶液的pH随着浓度变化不大,其pH均大于等电点,BSA分子一直带负电,不会影响实验结果。

表1 30～100 mg/mL BSA溶液pH测量

3.2 BSA的LLPS相图

上述实验中将BSA处于LLPS对应的较小YCl3浓度(c*=8 mmol/L)与较大YCl3浓度(c**=20 mmol/L)之间的范围称为临界盐浓度。接下来通过相同手段研究更大浓度范围BSA的LLPS临界盐浓度,如图4所示,根据30～100 mg/mL BSA分别对应的临界盐浓度绘制了BSA的LLPS相图。可见随着BSA浓度的增加,c*与c**都在逐渐上移,LLPS范围实现由窄到宽的过程。

图4 BSA的LLPS相图

3.3 BSA电泳迁移率数据分析

为了进一步分析YCl3诱导BSA发生LLPS的作用机制,我们采用动态光散射实验方法测定了BSA的电泳迁移率随YCl3浓度的变化。如图5所示,黑色曲线描述在恒定的40 mg/mL BSA质量浓度下,随着YCl3溶液浓度的增加,BSA球蛋白的电泳迁移率的变化趋势。随着YCl3溶液浓度的增加,BSA电泳迁移率实现由负到正的逐渐升高的转变,其中在YCl3溶液浓度对应约6 mmol/L时,BSA电泳迁移率实现由负到正的逆转,值得注意的是,电荷逆转节点与图4所展示40 mg/ml BSA发生LLPS的c**对应一致,这说明LLPS相行为本质上伴随着BSA表面电荷逆转。

图5 BSA电泳迁移率随YCl3浓度的变化

3.4 机制讨论

首先根据电泳迁移率数据探讨YCl3诱导BSA发生LLPS的静电相互作用理论机制:在水溶液中BSA是带负电荷的蛋白质[21],第一阶段对应较低的YCl3溶液浓度(<3 mmol/L)存在时,静电吸引作用驱使Y3+与BSA分子结合,这个过程中Y3+较好地与BSA暴露的带负电荷的侧链相互作用,从而调节表面电荷分布。由于Y3+浓度未达到补偿BSA表面净负电荷的数量,BSA分子因带同种电荷而相互排斥。第二阶段随着YCl3溶液浓度的增加(3～7 mmol/L),BSA表面吸引更多Y3+,达到一定浓度的Y3+可以适当补偿BSA表面的净负电荷,BSA分子之间的排斥相互作用被Y3+吸引相互作用所补偿,Y3+通过桥连不同的BSA导致原本相互排斥的BSA聚集在一起形成富含蛋白质的样品下层浓相。第三阶段中Y3+浓度过大而过度补偿导致BSA表面实现由负到正的电荷逆转,短程吸引和长程排斥的平衡导致了聚集物的重新溶解标志着LLPS的结束。如图6(左)所示,描述了YCl3诱导BSA发生LLPS的系统机制,随着YCl3浓度的增加会经历三个过程:首先当YCl3浓度小于c*时,少量Y3+与BSA结合,此时BSA复合物整体带负电,溶液呈透明状态;当YCl3浓度处于c*～c**时,Y3+桥接不同BSA分子,导致BSA分子凝聚,实现LLPS;最后YCl3浓度大于c**时,BSA复合物整体带正电而相排斥,溶液恢复透明。结合图6(右),从电荷逆转的角度描述了LLPS过程,可见LLPS状态的BSA基本处于表面电荷中和的状态,两端状态都因具有相同电荷而相互排斥。

图6 YCl3诱导BSA发生LLPS机制图(左)以及BSA表面电荷逆转(右)

本文通过样品现象记录、光学倒置显微镜观察直观的展现了BSA溶液的经历的一系列变化。结果表明:处于临界浓度的YCl3能够诱导BSA发生LLPS相行为。最后通过动态光散射实验得到BSA电泳迁移率数据对LLPS机制进行分析得出结论:一定浓度范围的Y3+与BSA表面的净负电荷相结合,BSA分子之间的排斥相互作用被Y3+吸引相互作用所补偿,Y3+通过桥连不同的BSA导致原本相互排斥的BSA聚集在一起形成富含蛋白质浓相。本课题对蛋白质LLPS研究具有一定的重要意义,尤其在LLPS病理方面或者LLPS机制方向的研究提供更有价值的参考。

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