李楠鑫，陈 洋，陈诗奇，张继甫，彭一丁，钟佳男，张 伟，符华林*

（1.四川农业大学动物医学院兽药创新制剂工程技术研究中心，成都 611130；
2.成都科宏达科技有限公司，四川 新津 611400）

近年来，消毒已成为预防各种畜禽传染病的重要措施，也是当前维护公共环境安全的重要方法。对畜禽场舍进行雾化消毒可以同时兼顾抗菌消毒及维护动物机体健康的双重目标，是规模养殖中常用的消毒方法之一[1]。烟雾机是利用燃烧产生的高温气体的热能和高速气体的动能，使消毒液受热而迅速烟化挥发呈烟雾状，雾滴粒径在10µm以内[2]，相对普通雾化消毒，烟雾消毒液雾滴更小，消毒效果更为彻底。烟雾消毒以消毒剂和烟雾助剂为药液，通过发烟机进行发烟，烟雾在空气中可长时间悬浮，可有效杀灭空气中浮游的有害病菌，切断病原菌传播途径。烟雾消毒已广泛应用于城市环卫、畜牧养殖业、垃圾污水处理场、大面积疾控防疫及公共场所消毒灭菌等领域[3]。但是消毒剂使用时是否会因烟雾化而对动物或者人体产生毒性影响也值得养殖场关注。

苯扎氯铵及癸甲溴铵是两种常见的阳离子表面活性剂，可以有效杀灭大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等养殖场常见细菌[4-6]。苯扎氯铵消毒剂属于低效消毒剂，被广泛应用于复方消毒剂、健康护理液（滴眼液、滴鼻液等）及化妆品中[7]。癸甲溴铵广泛应用于各种养殖场、宠物诊所的舍内环境、饮水、各种设备及器具、车辆及工作人员的消毒。目前暂无将苯扎氯铵及癸甲溴铵用于烟雾消毒的报道，为了科学评价烟雾消毒可能带来的对动物安全性的影响，本试验通过考察苯扎氯铵及癸甲溴铵烟雾消毒对试验大鼠呼吸道及全身安全性的影响，为苯扎氯铵及癸甲溴铵用于烟雾消毒提供依据。

1.1 药品与试剂

苯扎氯铵溶液、癸甲溴铵溶液、烟雾助剂（成都科宏达科技有限公司），生理盐水，水合氯醛及4%多聚甲醛（上海碧云天生物技术有限公司）。

BCA蛋白定量试剂盒、乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒、白蛋白（ALB）测定试剂盒、肌酐（Cr）测定试剂盒、尿素氮（BUN）测试盒、丙氨酸氨基转移酶（谷丙转氨酶/ALT/GPT）测试盒、天门冬氨酸氨基转移酶（谷草转氨酶/AST/GOT）测试盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 实验仪器

烟雾消毒机（成都科宏达科技有限公司），SZM-45B1显微镜（舜宇光学科技有限公司），TGL-16G离心机（江苏新康医疗器械有限公司）、FC酶标仪（赛默飞世尔科技），RM2235石蜡切片机（德国Leica），DM1000徕卡显微成像系统（德国Leica）。

1.3 实验动物

6～7周龄健康SPF级SD大鼠40只，雌雄各半，体重180～220 g，购自成都达硕实验动物有限公司。实验动物饲养遵循《实验动物饲养管理和使用指南》(Council,2010)，饲养环境温度（22±2）℃，相对湿度（60±10）%，常规饲料喂养（每天5～8 g/100 g体重）并自由饮水，适应性饲养5 d。

1.4 实验方法

1.4.1 实验动物分组

将40只大鼠于试验前分别称重并记录，然后随机分成4组，每组10只，具体分组设置见表1。

表1 试验分组Table 1 Experimental grouping

1.4.2 动物处理

在1 000 L可密闭透明有机玻璃柜，放入试验大鼠10只。启动烟雾机按照表1分组对相应药液进行发烟，待发烟机工作稳定，向密闭有机玻璃柜喷烟2 min相应药液，并保持雾化状态30 min。随后打开玻璃柜通风并移出大鼠于常规饲养环境；
各组每天按照前述烟雾化方式处理1次，连续进行14 d。试验期间，试验鼠可以自由采食、饮水。

1.4.3 试验观察

每天观察记录各组试验鼠的死亡情况、采食情况、饮水情况和每次通过喷烟前后试验鼠的形态及行为变化。描述并记录试验鼠的精神情况、毛色情况、二便情况、眼部情况、鼻口分泌物情况和其他行为状况，测定记录试验鼠呼吸频率。

1.4.4 生理生化指标测定

当试验进行至第14天时，称量各组体重，禁食16 h，分别通过眼眶后丛静脉与心脏采1.5 mL抗凝血与5 mL不抗凝血。抗凝血用于测定血红蛋白（Hb）、红细胞压积（HCT），红细胞（RBC）、白细胞（WBC）、血小板（PLT）计数与白细胞分类；
非抗凝血分离血清用于测定总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST），具体操作按试剂盒说明书执行。

1.4.5 肺洗涤液指标测定

采血结束后，脱颈椎处死大鼠，打开胸腔结扎左侧肺门。分离出颈部气管，在气管下端开小口，将粗针头插入气管并用细线扎紧，缓慢注入2.5 mL 0.9%氯化钠溶液，可见试验鼠右肺逐渐膨大，变白，停留10 s后，将灌洗液缓慢抽回，记录抽回体积，再重复一次以上操作，合并两次的灌洗液，置于5 mL EP管中。将灌洗液在4℃离心（1 500 r/min）15 min，测定上清液中蛋白含量及乳酸脱氢酶活性，具体操作按试剂盒说明书执行。

1.4.6 病理切片及观察

试验大鼠解剖并称量肝、肾、心、肺（包括进行肺部灌洗后的右肺）、睾丸（卵巢）湿重，计算脏/脑比值，采集脑、心、肺（只取未进行肺部灌洗的左肺）、肝、肾、睾丸（卵巢）制作病理切片，检查有无病理改变。检测方法步骤如下：

包埋：4%多聚甲醛固定的组织样本，经流水冲洗30 min，进行组织修块，放入病理包埋塑料筐中进行脱水（75%乙醇6 h，85%乙醇10 h，95%乙醇4 h，无水乙醇Ⅰ2 h，无水乙醇Ⅱ2 h），透明（二甲苯Ⅰ20 min，二甲苯Ⅱ15 min），浸蜡3 h，最后包埋组织块于石蜡中。

切片：采用Leica RM2235切片机将组织切成5µm厚的薄片，在温水中将组织展平后捞在载玻片上，60℃烘烤切片至少2 h。

染色：切片经二甲苯脱蜡后，流水洗涤20 min，用苏木素染色8 min，流水洗涤5 min，盐酸酒精分化，伊红染色3 min，最后梯度酒精脱水，二甲苯透明后用树脂胶封片。

显微镜下观察组织病理学变化，对正常组织或有明显病变部位均采用显微成像系统拍照记录。

2.1 大鼠行为观察结果

各组大鼠经烟雾消毒后精神状况良好，行为活跃。试验前后大鼠二便正常，鼠笼垫料基本保持正常干燥。试验前后眼部基本无变化，无明显分泌物。试验第2天，癸甲溴铵组大鼠烟雾消毒后开始出现鼻黏膜轻度出血；
第3～4天，除去离子水组外，其余组都开始出现鼻黏膜轻度出血，严重程度由高到低依次为Ⅱ>Ⅰ>Ⅲ>Ⅳ，各组大鼠鼻黏膜轻度出血后2 h内基本恢复正常。

2.2 大鼠体重增长、饮水量及脏器指数变化

各组大鼠经烟雾消毒后体重增长、日均饮水量如图1、2所示。各脏器指数变化结果如图3所示。各试验组大鼠与空白组相比14 d内体重增长及饮水量变化无显著性差异（P>0.05）。各试验组大鼠的脏/脑比与空白组相比均无显著性差异（P>0.05）。表明苯扎氯铵和癸甲溴铵经烟雾消毒后对动物生长性能没有影响。

图1 大鼠14 d体重增长变化Figure 1 Ponderal growth of rats for 14 days

图2 大鼠14 d日均饮水量Figure 2 Daily water intake of rats for 14 days

图3 各试验组大鼠的脏/脑比Figure 3 Dirty/brain ratio of rats in each experimental group

2.3 血液生化指标结果

各组大鼠经烟雾消毒后测得的血液生化指标结果如图4所示，各试验组大鼠与空白组相比，血清总蛋白含量、白蛋白含量、谷丙转氨酶含量、谷草转氨酶含量、肌酐含量、尿素氮含量均无显著性差异（P>0.05）。表明苯扎氯铵及癸甲溴铵烟雾消毒对动物生化指标没有显著影响。

图4 各组大鼠血液生化结果Figure 4 Blood biochemical results of rats in each group

2.4 血常规指标测定结果

各组大鼠经烟雾消毒后测得的血常规指标具体结果如图5所示，各试验组大鼠与空白组相比，血红蛋白浓度、红细胞压积、红细胞数目、白蛋白数目、血小板数目、淋巴细胞百分比、单核细胞百分比、中性粒细胞百分比都不具有显著性差异（P>0.05）。

图5 各组大鼠血常规指标结果Figure 5 Results of blood routine indexes of rats in each group

2.5 肺洗涤液指标测定结果

各组大鼠经烟雾消毒后测得肺洗涤液中蛋白质、LDH的测定结果如图6所示，与空白组相比，各组大鼠的肺洗涤液中总蛋白浓度和LDH值没有显著差异（P>0.05）。说明苯扎氯铵及癸甲溴铵经烟雾化后对动物呼吸道黏膜没有明显影响。

图6 肺洗涤液指标结果Figure 6 Index results of pulmonary washing fluid

2.6 病理切片结果

各组大鼠经烟雾消毒后各脏器切片见图7。心：各组心脏组织结构均未见异常，各心室壁及室间隔壁结构无明显病变，心肌胞浆红染，排列规律，胞核呈泡状或卵圆形，均无明显病理变化。肝：各组肝脏组织结构均未见异常，肝小叶明显，肝索清晰，肝窦内含少量红细胞。仅癸甲溴铵组部分肝脏见轻度空泡变性（2/6）（图8），这可能跟各组大鼠个体差异有关，其余组别肝脏细胞均无明显病理变化。脾：各组脾脏组织结构未见异常，白髓区可见明显淋巴小结和动脉周围淋巴鞘，淋巴细胞形态及数量未见明显异常；
红髓区脾索和脾窦形态结构正常，脾窦中红细胞丰富，淋巴细胞无明显病理变化。肺：各组肺组织结构未见明显异常，各级支气管未见明显异常。肺泡腔因灌注压力不均轻微扩张不均，肺泡壁血管及细胞成分均无明显病理变化。肾：皮质区肾小球数量及形态结构未见明显异常，皮质区和髓质区肾小管管腔结构正常，上皮细胞完整，刷状缘明显，未见明显病理变化。总体表明苯扎氯铵及癸甲溴铵烟雾消毒对大鼠脏器未有显著影响。

图7 大鼠脏器切片图Figure 7 Section of rat viscera

图8 癸甲溴铵组肝脏轻度空泡变性Figure 8 Mild hepatic vacuolar degeneration in deciquam solution group

3.1 烟雾消毒对大鼠行为的影响

烟雾消毒后各组大鼠行为基本无异常，除去离子水组外，其余组大鼠喷烟第3～4天后表现出轻微鼻腔出血症状，但2 h内基本恢复，说明烟雾消毒剂或烟雾助剂对大鼠鼻腔黏膜有轻微刺激性。

3.2 烟雾消毒对大鼠体重增长、饮水量及脏器指数的影响

动物的体重主要与发育和营养关系较大，生长过程中主要受营养条件及吸收功能所影响。在长期毒性试验时，药物可能是影响营养吸收的重要因素，从而导致其体重增加出现变化。传统的以脏器重量/体重来表示的脏器指数会有较大的波动，而脑重的变化受动物整体发育影响大，药物影响作用相对较小个别药物除外，所以脏脑比系数的波动主要反映脏器本身的变化，脑的因素其次。这样计算的脏脑比系数就可以直接反映出该脏器的相对重量变化。其结果比脏体比系数更能可靠和准确地表现出进行这项统计学检验的目的[8]。故本次试验脏器指数以脏脑比系数为评价指标。各试验组大鼠与空白组大鼠体重增长及脏器指数并无显著性差异（P>0.05），说明苯扎氯铵及癸甲溴铵烟雾消毒并不影响大鼠生长发育。

3.3 烟雾消毒对大鼠血液生化指标的影响

血液生化指标是指血液中的一些酶和蛋白质，这些小分子酶和蛋白质在代谢、免疫调节、能量传递及生长发育等方面发挥着十分重要的作用[9]。各试验组大鼠与空白组相比，血清总蛋白含量、白蛋白含量、谷丙转氨酶含量及谷草转氨酶含量均无显著性差异（P>0.05），说明苯扎氯铵、癸甲溴铵或烟雾助剂对大鼠的肝脏无实质性损伤；
各试验组大鼠与空白组相比，肌酐含量无显著性差异（P>0.05），说明苯扎氯铵、癸甲溴铵或烟雾助剂对大鼠的肾小球滤过功能无影响；
各试验组与空白组相比，血清中尿素氮含量无显著性差异（P>0.05），说明苯扎氯铵、癸甲溴铵或烟雾助剂对大鼠的肝、肾脏功能无影响。

3.4 烟雾消毒对大鼠血常规指标测定的影响

血常规主要对血液中的白细胞、红细胞、血小板3种细胞有形成分进行测定和分析[10]。各试验组大鼠与空白组相比，血常规指标测定结果都不具有显著性差异（P>0.05），说明苯扎氯铵、癸甲溴铵或烟雾助剂对大鼠正常的新陈代谢无影响，不会引起炎症反应[11]，对大鼠的免疫系统及非特异性细胞免疫功能无影响。

3.5 烟雾消毒对大鼠肺洗涤液指标测定的影响

肺洗涤液中蛋白质浓度的高低、LDH活性的大小主要与肺部作用机制和雾滴大小有关。一定大小的雾滴进入肺泡腔后，会被巨噬细胞吞噬，产生炎症介质和趋化因子，使肺泡、毛细血管屏障的通透性增加，血浆蛋白溢出，导致肺泡灌洗液中蛋白含量增高[12]。乳酸脱氢酶（LDH）是一种糖酵解酶,存在于机体所有组织细胞的胞质内，当细胞膜受损或通透性增加时可漏至细胞外，导致细胞外液中LDH的活性增加[13]。LDH活性的高低能反映膜损伤程度[14]。与空白组相比，各组大鼠的肺洗涤液中总蛋白浓度和LDH值没有显著差异（P>0.05），说明苯扎氯铵、癸甲溴铵和烟雾助剂在试验周期内未造成大鼠肺损伤。

苯扎氯铵及癸甲溴铵烟雾消毒对大鼠生长性能、生理生化及呼气道黏膜分泌并无影响，仅对鼻腔黏膜会产生轻微刺激性，但可很快恢复。苯扎氯铵及癸甲溴铵用于烟雾消毒对大鼠呼吸系统的毒力强度及刺激性强度并不强，苯扎氯铵烟雾消毒安全性更佳，但仍需进一步研究及改善。

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