初占宇，贾培松，，罗 影，努尔孜亚·亚力买买提，付永平，李 玉

(1.吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心，长春 130118；
2.新疆农业科学院植物保护研究所，乌鲁木齐 830091)

【研究意义】白灵侧耳(Pleurotustuoliensis)又称白灵菇，隶属于担子菌门、伞菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属[1-2]。白灵菇目前已实现产业化[3-4]。2010年我国白灵菇年产量高达323 713 t，2018年年产量55 832 t。在2010～2018年中白灵菇的病害也逐年上升，其中有细菌斑点病、菌褶滴水病、细菌性腐烂病、红菇病等细菌性病害[5]。新疆白灵菇主产区细菌性褐腐病普遍发生，严重时发病率达90%以上[6-7]。白灵菇褐腐病在严重季节可达90%～95%。在自然条件下，白灵菇子实体在发病初期子实体菌盖表面呈现水渍状病症，病变部分呈暗黄褐色，菌盖表面形成一薄层菌浓，有淡淡的臭味。发病中期，水渍状症状逐渐扩大，约占子实体表面的1/2，病变部分颜色逐渐加重，呈深褐色，臭味逐渐加重。发病后期，水渍状症状会蔓延至整个子实体，严重影响白灵菇的产量。该病的病原菌为托拉斯假单胞菌Pseudomonastolaasii，筛选出高效的防治药剂对减少细菌性腐烂病有实际意义。【前人研究进展】农业防治主要是通过改善栽培环境，加强栽培各流程的管理，降低白灵菇细菌性褐斑病发病率[6-7]。农业防治包括栽培场所的周边环境、栽培场所的卫生情况、白灵菇栽培料的配方、栽培过程中菌种的制作、栽培袋接种发菌、出菇管理、采摘管理等[8-10]。Fermor[13]从菇场、土壤、植物材料上分离出了一批P.tolaasii的拮抗细菌，这些细菌能显著降低褐斑病的发病程度，具有很高应用价值和研究价值。Soler-Rivas[14]发现Pseudomonasreactans产生的WLIP(white line inducing principle)能中和tolaasin毒素，在褐斑病生物防治中具有应用开发的潜力。Tsukamoto[15]从已经腐烂的糙皮侧耳子实体上分离到一株革兰氏阳性细菌，该细菌能显著降低托拉斯假单胞菌P.tolaasii产生tolaasin的概率。吕锐玲等[16]从大蒜、蒲公英和鱼腥草中筛选出大蒜粗提液对糙皮侧耳褐斑病病原细菌菌株PH-1具有显著抑菌作用，但发挥作用的物质以及抑菌机制尚需进一步研究。刘芹等[17]发现壳聚糖对托拉斯假单胞菌生长具有较好的抑制作用。【本研究切入点】针对白灵菇细菌性褐斑病，目前尚没有非常有效的化学防治药剂。四环素、链霉素、漂白粉液和二氧化氯等，化学药剂在实际防治过程中，效果都不是特别理想[11-12]。目前生物防治方面的研究主要集中在筛选拮抗菌和tolaasin毒素降解等。该病的病原菌有关药剂防治未见报道。【拟解决的关键问题】选取20种杀菌剂测定其对白灵菇褐腐病病原菌的毒力，筛选出高效、低毒和环境友好型杀菌剂，为有效防治该病害提供理论依据。

1.1 材 料

1.1.1 供试菌株

5株白灵菇褐腐病分离菌株，菌株编号分别为XJ2-3、XJ2-10、XJ4-6、XJ4-11、XJ7-2，分离自乌鲁木齐县和青河县的白灵菇感病子实体，并经柯赫氏法则验证致病性，菌株现保存于吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心(CCMJ)和新疆农业科学院植物保护研究所。表1

表1 供试菌株信息

1.1.2 培养基

LB营养琼脂培养基：酵母膏10 g，胰蛋白胨10 g，氯化钠5 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1 000 mL，pH7.0。

LB液体培养基：酵母膏10 g，胰蛋白陈10 g，氯化钠5 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0。

1.1.3 供试药剂

从市场上选取20种常用杀菌剂，剂型包括可湿性粉剂、水分散粒剂、悬浮剂、乳油、可溶液剂、水剂、水乳剂。表2

表2 20种供试杀菌剂信息

1.2 方 法

1.2.1 菌悬液制备

将病原菌菌株活化出现的单菌落，接种至200 mL LB液体培养基中，用记号笔标记接种人、接种日期及接种菌株编号，28℃ 150 r/min条件下，恒温震荡培养箱暗培养16 h，备用。将紫外分光光度计在450 nm处将吸光度调整为0.3。通过涂布平板法(取少量菌悬液滴加于LB固体培养基上，用灭过菌的涂布器，将菌液均匀的涂布在培养基表面)适当稀释的LB固体培养基上的活细胞计数，并将其放在28℃恒温培养箱中暗黑培养48 h。细菌菌悬液浓度(1.3±0.2)×108CFU / mL。

1.2.2 药剂初筛

用无菌水按照重量/体积比(或体积/体积比)将各供试药剂稀释300倍，备用。取配置好的菌悬液100 μL涂布于直径为9 cm的LB营养琼脂培养基平板上，将灭菌后的纸碟放置于平板培养基正中间，吸取100 μL药剂加至纸碟上，对照组添加100 μL无菌水，于28℃恒温箱中暗培养3 d，每个处理3次重复。记录纸碟周围有无明显抑菌现象，采用十字交叉法测量抑菌圈大小，计算抑菌率。

抑菌率(%)=(处理组抑菌圈直径-纸碟直径)/处理组抑菌圈直径×100%。

1.2.3 药剂浓度梯度

将初筛出来的杀菌剂设置300、500、700、900、1 100倍稀释液5个浓度稀释梯度和150、300、450、600、750倍稀释液5个浓度梯度，采用纸碟法测定各杀菌剂在不同浓度梯度下的抑菌圈直径，每个处理梯度重复3次，计算抑菌率。

1.3 数据处理

利用 SPSS 软件计算各杀菌剂毒力回归方程、相关系数(r)和抑菌率的大小以对各杀菌剂的毒力大小进行评价[18]。

2.1 白灵菇褐腐病病害防治药剂初筛

研究表明，46%二氯异氢尿酸钠、32%唑酮·乙蒜素对白灵菇褐腐病菌具有明显的抑制作用。100×108cfu/g枯草芽孢杆菌、60%唑醚·代森辛、50%烯酰吗啉、50%硫磺、50%咪鲜胺锰盐等18种杀菌剂对白灵菇褐腐病菌无明显的抑制作用。图1

图1 部分药剂初筛

2.2 二氯异氢尿酸钠药剂浓度梯度评价

研究表明，在稀释浓度为300倍下，二氯异氢尿酸钠抑菌率区间为36%～62%，在同样的稀释浓度下，不同菌株之间存在一定差异。在稀释浓度为300倍下，XJ7-2的抑制率明显高于其他4个菌株，但随着稀释浓度逐渐增大，抑菌率逐渐变小，在稀释浓度为1 100倍下，5个菌株的抑菌率区间仅为7%～29%。抑菌率越大药剂毒力越强。药剂二氯异氢尿酸钠在稀释浓度300倍下，抑菌效果最为明显。表3

2.3 唑酮·乙蒜素药剂浓度梯度评价

研究表明，在稀释浓度为150倍下，唑酮·乙蒜素抑菌率区间为41%～50%，在稀释浓度为150倍下，XJ4-6的抑菌率为50%，抑制率明显高于其他4个菌株。随着稀释浓度逐渐增大，抑菌率逐渐减小。当稀释浓度为750倍下，抑制率区间为3%～16%。随着稀释浓度逐渐增大，抑菌率逐渐变小。故药剂唑酮·乙蒜素在稀释浓度150倍下，抑菌效果最为明显。表4

表3 46%二氯异氢尿酸钠对白灵菇褐腐病菌的毒力回归方程

针对白灵菇褐腐病室内及田间化学防治药剂的筛选迫切重要[19-20]。选择新疆地区常用的20种商品杀菌药剂对白灵菇褐腐病菌进行室内抑菌，试验初筛得到抑菌效果较好的2种杀菌药剂，并将2种杀菌剂采用纸碟法分别进行室内毒力显示，在稀释浓度为150倍下，唑酮·乙蒜素抑菌率区间为41%～50%，在稀释浓度为300倍下，二氯异氢尿酸钠抑菌率区间为40%～62%，2种药剂杀菌效果皆明显，且2种商品药剂又都属于高效、低毒和环境友好型杀菌剂，可作为后续田间药剂防治试验的首选药剂。在采取农药防治的同时根据不同的实际情况选择合适的农业防治措施配合防治，如从培育和引进抗性品种、增强品种的抗病性、及时清除病残体等全方面防控措施[21-23]。

表4 32%唑酮·乙蒜素对白灵菇褐腐病菌的毒力回归方程

防控中也应避免单一药剂的多年重复施用，可将此次筛选出的2种药剂复配、交替使用，得到较理想的田间防控效果。

筛选获得在稀释浓度为150倍下，唑酮·乙蒜素抑菌率区间为41%～50%，在稀释浓度为300倍下，二氯异氢尿酸钠抑菌率区间为36%～62%，2种药剂杀菌效果皆明显。唑酮·乙蒜素和二氯异氢尿酸钠作为白灵菇褐腐的防治药剂。

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