吉兰洁 李鹏辉 张芳 顾娟娟 付永祥 王银姗 卢昭 金凯 李慧敏 闫镛

2 型糖尿病(type 2 diabetes,T2DM)是常见的慢性病之一。

T2DM 动物模型是研究糖尿病发病机制和临床防治的基础,高脂饮食联合链脲佐菌素建立动物模型是一种常见的造模方法,该模型适应于研究T2DM 发病机制及评价药物降糖效果等实验[1]。中医治疗T2DM 注重整体调节、辨证论治、综合调理,以达到阴阳平衡、气血调和、气机调畅、脏腑协调、清升浊降、在平稳调糖的基础上,还具有缓解症状的优势[2],同时中药通过保护胰岛β 细胞及增加胰岛素敏感性,改善胰岛素抵抗,改善机体氧化应激水平等途径发挥防治糖尿病的作用[3]。

连术消渴颗粒以运脾清热、泄浊祛瘀为治则,在临床上常用于改善T2DM 血糖、血脂、胰岛素抵抗等。

本研究通过观察连术消渴颗粒对T2DM 模型大鼠血清炎症水平、肝脏脂代谢、氧化应激及肝脏病理变化的影响,为进一步研究连术消渴颗粒在T2DM 中的具体作用机制奠定基础。

现报道如下。

1.1 实验动物

健康SD 雄性大鼠,购于济南朋悦实验动物繁育有限公司,体质量200 ~ 220 g,动物合格证号1107261911004137; 生产许可证号 SCXK (鲁)20190003;实验室使用许可证编号SYXK(豫)2015-0005,于22 ℃、50%湿度条件下实验室饲养后随机分组。

1.2 实验试剂与仪器

连术消渴颗粒(成人每日34.98 g)为中药配方颗粒,相当于含黄连30 g、炒苍术12 g、炒枳实10 g、升麻 10 g、陈皮12 g、姜半夏 10 g、山楂 30 g、神曲10 g、泽泻 30 g、茯苓 15 g、僵蚕 10 g、水蛭 3 g、干姜10 g、大枣10 g、甘草6 g,由广东一方制药有限公司统一提供,批号:20190807。

盐酸二甲双胍片产自中美上海施贵宝制药有限公司,批号:H20023370。

柠檬酸(天津市致远化学试剂有限公司,批号:2017508);柠檬酸钠(天津市致远化学试剂有限公司,批号:2017402);链脲佐菌素(streptozotocin,STZ) (上海麦克林生化科技有限公司,批号:CI0584849);甲醛溶液(西陇科学股份有限公司,批号:1901232);大鼠血清一氧化氮(nitric oxide,NO)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、肝组织匀浆中甘油 三 酯 (triglyceride, TG)、 总 胆 固 醇 ( total cholesterol,TC)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)、 丙 二 醛 ( malondialdehyde,MDA)的ELISA 检测试剂盒均为96T,批号分别为:E20200608A、E20201022A、E20201021A、E20201124A、E20201123A、E20201218A、E20201028A、E20201123A,均产自苏州卡尔文生物科技有限公司。

血糖仪[江苏鱼跃医疗设备股份有限公司,Ⅱ型(730)];血糖试纸(江苏鱼跃医疗设备股份有限公司,190311);电子秤(广东香山衡器集团股份有限公司,EK813);电子天平[梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司,AL204];高速冷冻离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司,KDC-160HR);可调式移液器(上海雷勃分析仪器有限公司);电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司,DHG-9038A);洗板机(美国伯腾仪器有限公司,50TS8);酶标仪(美国BIO-RAD 公司,680 型);电泳仪(美国BIO-RAD 公司,mini protean 3 cell)。

1.3 造模、分组及给药

72 只成年健康SD 雄性大鼠,于实验室适应性饲养3 天后,随机分为连术消渴颗粒高剂量组、连术消渴颗粒中剂量组、连术消渴颗粒低剂量组、二甲双胍组、模型组及空白组,每组12 只。

空白组给予正常饲养;其余各组大鼠给予高脂高糖饲料喂养(基础饲料+1.5%胆固醇+10%蛋黄粉+10%猪油+0.25%胆盐+5%蔗糖),饲养30 天后大鼠禁食12 小时,腹腔注射STZ45 mg/kg(0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液,pH 4.2),空白组大鼠腹腔注射等量柠檬酸盐缓冲液。

1 周后,于大鼠尾部少量取血,T2DM 成模标准为:空腹血糖≥11.1 mmol/L, 随机血糖≥16.7 mmol/L[4]。

连术消渴颗粒高、中、低剂量组大鼠分别给予 11.68、5.84、2.92 g/(kg·d)连术消渴颗粒灌胃,盐酸二甲双胍组大鼠给予0.17 g/(kg·d)盐酸二甲双胍片灌胃,空白组及模型组给予相同剂量的纯净水灌胃。

各组大鼠均每日给药1 次,连续给药30 天。

于每10 天称体质量1次,根据大鼠体质量变化调整用药量。

1.4 血清炎症因子相关指标检测

末次给药后禁食不禁水12 小时,腹腔注射10%水合氯醛麻醉后,经腹主动脉采血,并取出完整肝脏。

留取血清,测定血清中 NO、NOS、TNF-α、SOD水平,所有操作严格按照相应试剂盒的说明书进行。

1.5 脂代谢及氧化应激相关指标检测

取一定量肝脏组织,剪碎,以无菌生理盐水研磨为10%的组织匀浆,测定其中 TG、TC、GSH-Px、MDA 含量。

1.6 肝组织形态观察

取部分肝组织以多聚甲醛浸泡固定24 小时,按步骤脱水,包埋,切片,HE 染色,封固。

显微镜下观察各组大鼠肝组织形态。

1.7 统计学方法

使用SPSS19.0 进行统计学处理,计量资料符合正态分布,方差齐,结果以平均值±标准差()表示,多组间比较用单因素方差分析,病理半定量分析采用Ridit 检验,以P<0.05 为具有统计学意义,以P<0.01 为统计学意义显著。

2.1 连术消渴颗粒对STZ 合并特殊膳食致大鼠糖尿病模型血清 NO、NOS、TNF-α、SOD 水平的比较

与空白组相比,模型组大鼠血清中NO、NOS、TNF-α水平显著升高(P<0.01),SOD 水平显著降低(P<0.01)。

与模型组比,二甲双胍组和连术消渴颗粒高剂量组可使大鼠血清 NO、NOS、TNF-α 水平显著降低(P<0.01),SOD 水平显著升高(P<0.01);连术消渴颗粒中剂量组可使大鼠血清NO 水平降低(P<0.05),血清 NOS、TNF-α 水平显著降低(P<0.01),SOD 水平显著升高(P<0.01);连术消渴颗粒低剂量组可使大鼠血清 NO、NOS、TNF-α 水平降低(P<0.05),SOD 水平升高(P<0.05)。

结果详见表1。

表1 各组大鼠血清NO、NOS、TNF-α、SOD 水平的比较()

表1 各组大鼠血清NO、NOS、TNF-α、SOD 水平的比较()

注: 与空白组相比,aP<0.01;与模型组相比,bP<0.05,cP<0.01。

组别 鼠只 剂量(g/kg) NO(μmol/L) NOS(μmol/L) TNF-α(pg/mL) SOD(U/mL)94±8.79模型组 12 - 26.38±3.12a 30.04±1.58a 231.26±24.40a 134.63±6.78a二甲双胍组 12 0.17 22.47±2.51c 26.68±2.15c 190.13±14.14c 149.40±5.47c连术消渴颗粒高剂量 12 11.68 22.89±2.68c 27.09±1.91c 191.81±21.11c 146.47±7.38c连术消渴颗粒中剂量 12 5.84 23.16±2.74b 27.57±1.9c 199.48±13.99c 145.38±9.08c连术消渴颗粒低剂量 12 2.92 23.36±2.54b 27.94±2.36b 212.72±13.35b 142.06±8.34空白组 12 - 21.29±2.74 25.99±1.39 169.30±17.84 155.b

2.2 连术消渴颗粒对STZ 合并特殊膳食致大鼠糖尿病模型肝脏脂代谢、氧化应激指标比较

与空白组比,模型组大鼠肝组织匀浆TG、TC、MDA 水平显著升高(P<0.01),GSH-Px 水平显著下降(P<0.01)。

与模型组比,连术消渴颗粒高、中剂量组和二甲双胍组大鼠肝组织匀浆TG、TC、MDA 水平显著降低(P<0.01),GSH-Px 活性显著升高(P<0.01);连术消渴颗粒低剂量组大鼠肝组织匀浆TC 水平显著降低(P<0.01),TG、MDA 水平下降(P<0.05),GSH-Px 水平显著升高(P<0.01)。

结果详见表2。

表2 各组大鼠肝组织匀浆TG、TC、GSH-Px、MDA 水平的比较()

表2 各组大鼠肝组织匀浆TG、TC、GSH-Px、MDA 水平的比较()

注: 与空白组相比,aP<0.01;与模型组相比,bP<0.05,cP<0.01。

组别 鼠只 剂量(g/kg) TG(mmol/L) TC(mmol/L) GSH-Px(U/L) MDA(nmol/mL).43模型组 12 - 1.53±0.15a 6.35±0.97a 98.88±10.40a 8.04±0.55a二甲双胍组 12 0.17 1.28±0.11c 5.14±0.37c 105.10±7.01c 7.25±0.42c连术消渴颗粒高剂量 12 11.68 1.32±0.71c 5.29±0.21c 106.34±11.56c 7.35±0.52c连术消渴颗粒中剂量 12 5.84 1.35±0.73c 5.40±0.25c 107.40±8.08c 7.50±0.27c连术消渴颗粒低剂量 12 2.92 1.41±0.67b 5.59±0.41c 111.56±10.64c 7.67±0.23空白组 12 - 1.22±0.88 4.93±0.28 121.47±10.32 7.17±0 b

2.3 连术消渴颗粒对STZ 合并特殊膳食致大鼠糖尿病模型肝脏组织形态比较

经Ridit 检验,与空白组相比,模型组大鼠肝组织病理变化显著(P<0.01),肝小叶结构散乱,肝细胞凝固性坏死、重度水肿,肝细胞索和肝窦排列无规律不规则。

与模型组相比,连术消渴颗粒高剂量组和二甲双胍组大鼠肝组织病理变化显著改善(P<0.01),连术消渴颗粒中剂量组大鼠肝脏病理变化有改善(P<0.05),连术消渴颗粒低剂量组大鼠肝脏病理变化有改善的趋势,差异无统计学意义(P>0.05)。

结果详见表 3 及图 1。

图1 各组大鼠肝组织形态比较(HE 染色,×20)

表3 各组大鼠肝组织病理变化比较

现代医学的“糖尿病”常归于中医学“消渴病”范畴。

研究发现,湿热互结证已成为当代T2DM 常见的主要证型之一,同时糖尿病体质类型中湿热质尤为常见[5-7]。

“痰、热、瘀、毒”,为 T2DM 发生发展的重要病机之一[8],且“炎症”“氧化应激”的发生机理与中医学“毒”邪理论亦有密切相关性[9],具有祛湿、清热、解毒作用的中药及复方均可抑制炎症[10]。课题组结合T2DM 发病特点,总结认为饮食不节,脾失健运,湿热互结是其主要病机之一,其中脾失健运为其始动因素,湿热耗伤气阴是T2DM 发病的内在因素,瘀血贯穿于疾病始终,据证立法,以法组方,提出运脾清热,泄浊祛瘀的主要治则,创制连术消渴方。

方中黄连、苍术共为君药,以顺应脾性,燥湿运脾。

升麻、枳实相伍,一升一降,以助脾运。

陈皮、姜半夏、茯苓、泽泻四味合用,使湿无所聚,痰无由生;山楂、神曲运脾开胃,通利血脉;僵蚕、水蛭合用以攻积久之滞,以上诸药共为臣药。

干姜温护中焦,以为佐药,大枣健脾益气、甘草补脾和中,用以为使。

全方标本兼顾,使脾运、浊化、瘀消,则气机调达,三焦、经络通畅,消渴自已。

前期临床研究显示,连术消渴颗粒可有效降低T2DM(痰热互结型)患者血糖、血脂水平,改善其临床症状及体征,改善胰岛素抵抗状态[11-14]。

实验研究显示,连术消渴颗粒可以降低T2DM 模型大鼠的空腹血糖及糖基化血清蛋白水平、改善大鼠饮食量、饮水量、体重等表观指标[15],修复并保护其肠黏膜屏障功能,促进结肠水通道蛋白的表达[16],可见该方对T2DM 具有一定的防治作用。

血清TNF-α 常作为评价机体炎症状态的重要指标,可诱导胰岛细胞损伤[17]。

SOD、GSH-Px 是机体抗氧化系统中重要的抗氧化酶[18],能够清除过量的活性氧(reactive oxygen species,ROS),保持细胞氧化还原处于平衡状态。

NO、NOS 与机体氧化应激关系密切,在T2DM 发展中发挥重要作用[19]。

NOS 在高糖状态下过度表达,从而生成大量的 NO,损伤机体[20]。

MDA 是脂质过氧化裂解生成的最终产物[21],常作为反映氧化应激的关键生物标志物之一,T2DM 体内MDA 水平可能高于正常者,其浓度与细胞损伤程度相关[22]。

本研究结果显示,与空白组比较,模型组大鼠血清 NO、NOS、TNF-α 水平及肝组织匀浆 TG、TC、MDA水平显著升高,血清SOD 水平及肝组织匀浆GSH-Px水平显著降低,且肝脏组织形态显示肝小叶结构散乱,肝细胞凝固性坏死、重度水肿,肝细胞索及肝窦排列无规律不规则,病理变化显著(均P<0.01),这与现代研究结果一致。

现代研究表明,T2DM 者体内胰岛素抵抗状态常不同程度减弱机体调节脂肪代谢的能力,对脂肪的分解代谢产生抑制作用,使肝细胞内出现脂肪堆积[23],久而形成脂肪肝,肝脏抗氧化能力降低;胰岛素抵抗又可促使外周脂肪动员增强,使血中游离脂肪酸生成增多,产生炎症及氧化应激状态[24]。

T2DM 机体胰岛素抵抗状态与炎症及氧化应激状态长期共存[25],且关系密切。

本研究结果中,各剂量组连术消渴颗粒均能降低 T2DM 模型大鼠血清 NO、NOS、TNF-α 水平及肝组织匀浆中 TG、TC、MDA 水平,升高血清 SOD 及肝组织匀浆GSH-PX 水平,与模型组比,连术消渴颗粒高剂量组可使大鼠肝脏病理变化显著改善(P<0.01),连术消渴颗粒中剂量组可使大鼠肝脏病理变化改善(P<0.05),连术消渴颗粒低剂量组大鼠肝脏病理变化有改善的趋势(P>0.05)。

可见连术消渴颗粒具有调节T2DM 模型大鼠脂代谢,改善炎症状态、氧化应激反应的作用,且可改善大鼠肝脏组织病理。

综上所述,连术消渴颗粒能够有效降低T2DM大鼠肝组织匀浆TG、TC 水平,起到降糖调脂的作用,其机制可能与降低炎症因子水平、改善机体氧化应激状态及肝脏病理变化相关,为临证防治T2DM提供了依据。

但该方作用途径尚未明确,有待进一步研究,以期充分阐明连术消渴颗粒具体作用机制。

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