李曼曼,沈习习,王莎莎,沈娟,唐长波,王玮

(南京农业大学食品科学技术学院/国家肉品质量安全控制工程技术研究中心/农业农村部肉及肉制品质量监督检验测试中心(南京),江苏 南京 210095)

有机氯农药(organochlorine pesticide,OCP)作为我国使用时间较长、使用量较大的一大类含氯化合物,因其具有价廉高效的优点而广泛用于防治害虫[1]。OCP化学性质稳定,可长期存在于土壤、水域、大气等环境中,并能通过食物链富集至动物体内,从而导致畜禽肉中出现农药残留情况[2]。OCP摄入人体后,会刺激人体神经系统,导致头晕、头痛、失眠等症状,还会破坏人体的肝脏功能、生殖系统及免疫系统等[3]。世界各国于20世纪70年代末至80年代初开始禁止使用OCP。我国也于1983年停止生产OCP,并于1986年在农业上全面禁止使用[4]。与此同时,世界各国和国际组织也制定了严格的畜禽肉中OCP最大允许残留限量(maximum residue limit,MRL),如欧盟、日本、中国在畜禽肉中分别规定了12、10、10项MRL[5-7]。我国作为畜禽肉生产和消费大国,其质量安全问题直接影响到消费者健康和动物产品进出口贸易[8]。因此,建立简便高效、灵敏准确的畜禽肉中农残检测方法尤为重要。

畜禽肉因脂肪、蛋白含量较高,致使其基质较为复杂。因此,为减少农药检测过程中的基质干扰现象,关键在于选择合适的样品前处理方法。当前,畜禽肉中农药残留检测的前处理方法主要有凝胶渗透色谱法[9]、固相萃取法[10]、加速溶剂萃取法[11]、QuEChERS(quick,easy,cheap,effective,rugged,safe)法[12]等。上述前3种方法虽能准确分离农药残留组分,但操作繁琐,分析时间长,需消耗大量试剂[13];而QuEChERS法具有检测效率高、成本低、操作简便、回收率高、环境友好等优势[14]。因此,本试验选择QuEChERS法作为样品前处理方法。农药残留检测方法主要有酶联免疫吸附法(ELISA)[15]、气相色谱法(GC)[16]、高效液相色谱法(HPLC)[17]、高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)[18]、气相色谱-三重四级杆串联质谱法(GC-MS/MS)[19]等。其中,ELISA的抗体有效性短,易出现假阳性结果[20];GC不能检测高沸点、挥发性差、热稳定性差的样品,检测农药范围受限[21];HPLC易受复杂基质干扰,检测农药种类少,灵敏度低[22];HPLC-MS不能进行二级质谱扫描,抗干扰能力较差,且对于痕量物质分析有一定缺陷[23];而GC-MS/MS采用离子对及其比值进行分析定性,其多反应监测模式能减少样品复杂基质的干扰,其中尤以QuEChERS前处理与GC-MS/MS方法结合更能发挥农药残留高效分离、高选择性、高灵敏度和高准确度的优势[24-25]。因此,本试验基于QuEChERS前处理方法,建立了一种可同时检测畜禽肉中17种OCP的GC-MS/MS方法,旨在为畜禽肉中农药残留快速检测以及食品安全提供科学支持和技术保障。

1.1 材料与试剂

供试材料为生鲜猪肉、牛肉、羊肉、鸭肉、鸡肉,购于江苏省南京市农贸市场和超市;阴性畜禽肉由农业农村部肉及肉制品质量监督检验测试中心(南京)提供。

标准品:α-六六六(α-BHC)、β-六六六(β-BHC)、γ-六六六(γ-BHC)、δ-六六六(δ-BHC)、o,p′-滴滴涕(o,p′-DDT)、p,p′-滴滴涕(p,p′-DDT)、p,p′-滴滴伊(p,p′-DDE)、p,p′-滴滴滴(p,p′-DDD)、α-硫丹(α-endosulfan)、β-硫丹(β-endosulfan)、狄氏剂(dieldrin)、艾氏剂(aldrin)、硫丹硫酸酯(endosulfan-sulfate)、顺式-氯丹(cis-chlordane)、反式-氯丹(trans-chlordane)、环氧七氯B(heptachlor-exo-epoxide B)、七氯(heptachlor),质量浓度均为100 μg·mL-1,购于上海安谱实验科技股份有限公司。

试剂:乙腈、正己烷、丙酮、乙酸,均为色谱纯,购于上海安谱实验科技股份有限公司;无水硫酸钠(Na2SO4)、无水硫酸镁(MgSO4)、氯化钠(NaCl)、醋酸钠(CH3COONa)、柠檬酸钠(C6H5Na3O7)、柠檬酸二钠倍半水合物(C6H6Na2O7),均为分析纯,购于上海安谱实验科技股份有限公司;N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基键合硅胶(C18),粒径均为40 μm,购于美国Agilent公司。

1.2 仪器与设备

TSQ 8000 Evo三重四级杆气质联用仪和TG-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)购于美国Thermo Fisher Scientific公司;D-16C高速离心机和CPA224S电子天平购于德国Sartorious公司;N-EVAP型氮吹仪购于美国Organomation公司;Vortex Genius漩涡混匀器购于德国IKA公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理1)提取:称取5.00 g均质样品于50 mL离心管中,加入10 mL乙腈提取,涡旋混匀1 min;再加入柠檬酸缓冲体系盐包(1 g MgSO4、1 g NaCl、1 g C6H5Na3O7、0.5 g C6H6Na2O7,pH4.5),涡旋混匀1 min,4 ℃、10 000 r·min-1离心5 min。2)净化:转移上清液置于装有1 g MgSO4、0.1 g PSA、0.15 g C18吸附剂的离心管中,涡旋混匀1 min,4 ℃、10 000 r·min-1离心5 min;再次转移上清液于新的50 mL离心管中,40 ℃氮吹近干,加入1 mL正己烷复溶,涡旋混匀1 min;取复溶液体过0.22 μm滤膜,供GC-MS/MS检测。

1.3.2 标准溶液的配制1)混合标准溶液:分别移取17种OCP标准品各1.00 mL,用正己烷稀释定容至20 mL,配制成质量浓度为5.00 μg·mL-1的混合标准溶液,-20 ℃贮存备用。

2)混合标准工作溶液:移取2.00 mL混合标准溶液,用正己烷稀释定容至10 mL,配制成质量浓度为1.00 μg·mL-1的混合标准工作溶液,-20 ℃贮存备用。

3)基质匹配混合标准工作溶液:准确移取适量混合标准工作溶液,用空白基质提取液稀释,配制成系列浓度梯度为0.005、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 μg·mL-1的基质匹配混合标准工作溶液,现配现用。

1.3.3 GC-MS/MS方法的优化与建立1)气相色谱条件 色谱柱:TG-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);载气:高纯氦气(99.999%);恒流模式流速:1.0 mL·min-1;进样方式:不分流进样;进样量:1 μL;进样口温度:250 ℃;升温程序:60 ℃保持1 min,以16 ℃·min-1升到150 ℃,再以10 ℃·min-1升到200 ℃,最后以3 ℃·min-1升到220 ℃,保持6 min。

2)质谱条件 离子源:电子轰击离子源(electron impact ion source,EI);电离能量:70 eV;离子传输线温度:280 ℃;离子源温度:230 ℃;溶剂延迟时间:5 min;扫描离子范围:50～450 u;扫描方式:多反应监测模式(multiple reaction monitoring,MRM)。

1.4 方法评价

1.4.1 基质效应(matrix effect,ME)ME是指样品中其他组分对目标化合物的测定过程产生干扰,影响其测定结果,可分为基质增强和基质减弱效应[26]。ME可通过基质匹配标准曲线与纯溶剂中标准曲线的斜率(k)表示,即ME=k基质/k纯溶剂[27]。当ME>1时,为基质增强效应;ME<1为基质减弱效应;ME=1,则不存在基质干扰现象。一般认为,当ME为0.8～1.2时,为弱基质效应;当ME<0.8或>1.2时,基质效应较强[28]。

1.4.2 线性范围、检测限及定量下限的确定基于已建立的GC-MS/MS方法,将配制好的基质匹配标准工作溶液上机测定,质量浓度范围为0.005～0.500 μg·mL-1,共设置7个浓度点。以定量离子质量色谱峰面积为纵坐标(Y),对应溶液质量浓度(μg·mL-1)为横坐标(X),绘制标准曲线,求得回归方程,计算平方相关系数(square of correlation coefficient,R2)。分别在阴性畜禽肉中添加10 μg·kg-1OCP混合标准溶液进行测定,以3倍信噪比计算各农药的检测限(limit of detection,LOD),10倍信噪比计算各农药的定量下限(lower limit of quantitation,LLOQ)[29]。

1.4.3 准确度和精密度试验在阴性畜禽肉中分别添加10、20、50 μg·kg-13个水平的OCP混合标准品,每个浓度设6个平行。以平均回收率评价该方法的准确度,并根据平行样品的相对标准偏差(RSD)评价该方法的精密度。

1.4.4 方法的实际应用选用市售生鲜肉30份,其中猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉各6份,15份购自超市,15份购自农贸市场。参照1.3.1和1.3.3节进行样品前处理和上机测定,以评价该方法的实际应用效果。

2.1 QuEChERS前处理条件优化

2.1.1 提取试剂的优化考虑到OCP的溶解特性,本试验分别选取乙腈、1%乙酸乙腈、丙酮-正己烷(体积比1∶1)、丙酮、正己烷作为样品提取试剂。在其他试验条件相同情况下,分别向5种阴性基质中添加 20 μg·kg-1农药混合标准品,以17种有机氯农药(OCP)回收率为指标,比较5种不同提取剂的提取效果。由图1可知:乙腈在5种基质中均呈现出最佳的提取效果,其回收率在60%～120%的农药种类数量较多。因此,本试验选用乙腈作为提取溶剂。

图1 提取溶剂对17种有机氯农药(OCP)回收率的影响Fig.1 Effect of extraction solvents on the recovery of 17 organochlorine pesticide(OCP)

2.1.2 萃取盐包的选择样品经乙腈提取后,需要加入盐析剂使水相和有机相分离。本试验选择4种不同萃取盐包组合,分别为普通盐包1(2 g Na2SO4+2 g NaCl)、普通盐包2(1 g MgSO4+1 g NaCl)、醋酸缓冲体系盐包(2 g MgSO4+1.5 g CH3COONa)、柠檬酸缓冲体系盐包(1 g MgSO4+1 g NaCl+1 g C6H5Na3O7+0.5 g C6H6Na2O7)。在其他试验条件相同情况下,分别向5种阴性基质中添加20 μg·kg-1农药混合标准品,通过17种有机氯农药回收率来比较不同萃取盐包的萃取效果。由图2可知:柠檬酸缓冲体系盐包(1 g MgSO4+1 g NaCl+1 g C6H5Na3O7+0.5 g C6H6Na2O7)在5种基质中均显示出最佳的萃取效果,其回收率均为60%～120%。因此,本试验选择柠檬酸缓冲体系盐包作为萃取盐包。

图2 萃取盐包对17种OCP回收率的影响Fig.2 Effect of extraction salt packs on the recovery of 17 OCP

2.1.3 吸附剂用量的优化样品经初步净化后需采用MgSO4、PSA、C18等吸附剂对有机相进行进一步净化和除水。其中,MgSO4可除去提取液中少量水分;PSA因含有伯胺和仲胺,可有效去除脂肪酸、有机酸及一些极性色素和糖类;C18主要依靠非极性相互作用吸附脂肪等物质,可通过调节PSA与C18比例达到较好的去脂效果。本试验选用4种不同配比的吸附剂组合,分别为吸附剂组合1(1 g MgSO4+0.1 g PSA+0.1 g C18)、吸附剂组合2(1 g MgSO4+0.1 g PSA+0.15 g C18)、吸附剂组合3(1 g MgSO4+0.1 g PSA+0.2 g C18)、吸附剂组合4(1 g MgSO4+0.15 g PSA+0.1 g C18)。在其他试验条件相同情况下,分别向5种阴性基质中添加20 μg·kg-1农药混合标准品,通过17种OCP回收率来比较不同吸附剂用量的净化能力。由图3可知:吸附剂组合2(1 g MgSO4+0.1 g PSA+0.15 g C18)在5种基质中均呈现出最佳的净化效果,其回收率均为60%～120%。因此,本试验选择1 g MgSO4+0.1 g PSA+0.15 g C18作为吸附剂。

图3 吸附剂对17种OCP回收率的影响Fig.3 Effect of adsorbents on the recovery of 17 OCP

图4 17种OCP标准溶液的总离子流色谱图(5 μg·mL-1)Fig.4 Total ion flow chromatograms of 17 OCP standard solutions(5 μg·mL-1)1. α-六六六α-BHC;2. β-六六六β-BHC;3. γ-六六六γ-BHC;4. δ-六六六δ-BHC;5. 七氯Heptachlor;6. 艾氏剂Aldrin;7. 环氧七氯B Heptachlor-exo-epoxide B;8. 顺式-氯丹cis-chlordane;9. β-硫丹β-endosulfan;10. 反式-氯丹trans-chlordane;11. p,p′-滴滴伊p,p′-DDE;12. 狄氏剂Dieldrin;13. α-硫丹α-endosulfan;14. p,p′-滴滴滴p,p′-DDD;15. o,p′-滴滴涕o,p′-DDT;16. 硫丹硫酸酯Endosulfan-sulfate;17. p,p′-滴滴涕p,p′-DDT.

2.2 GC-MS/MS仪器条件优化

2.2.1 色谱条件的确定本试验选取高惰性的弱极性TG-5MS毛细管柱,探讨升温程序对OCP分离效果的影响。选择初始温度为50和60 ℃,分别保持1、2、3 min,再分别以14、15、16 ℃·min-1的速率升至 150 ℃,比较升温程序对出峰时间的影响;后续比较3种不同升温程序:(1)1.3.3节试验方法中的升温程序;(2)12 ℃·min-1升至200 ℃,5 ℃·min-1升至220 ℃,保持10 min;(3)10 ℃·min-1升至200 ℃,3 ℃·min-1升至220 ℃,保持10 min,考察其对17种OCP分离效果的影响。结果表明,初始温度为60 ℃时,出峰较快,保持时间延长使整体出峰延后,因此选择初始温度为60 ℃,保持1 min;17种OCP均在温度高于150 ℃出峰,前期升温速率越高,出峰越早,因此选择以16 ℃·min-1的速率升温至150 ℃;后续升温程序方法(2)中升温速率过快,p,p′-滴滴伊、狄氏剂、p,p′-滴滴滴、o,p′-滴滴涕未能完全分开;方法(3)中保持时间长,导致分析时间长、效率低。因此,本试验选择1.3.3节中的升温程序,此时17种OCP分离度较好、响应高,可进行定性分析(图4)。

2.2.2 质谱条件的确定本试验在1.3.3节选定的色谱条件下,将1 μg·mL-1OCP混合标准溶液注入GC-MS/MS中进行全扫描,确定各化合物母离子;对母离子进行选择反应监测模式扫描,优化出3个强度和质荷较大的碎片离子作为子离子;然后通过子离子来进行碰撞能量的优化,最终获得17种OCP的质谱参数(表1)。按照上述条件,得到17种OCP混合标准溶液的二级质谱图,如图5所示。

2.3 方法的线性范围、检测限、定量下限及基质效应

由表2可知:β-六六六在5种畜禽肉基质中均表现为基质减弱效应,而其他农药却表现为基质增强效应。本试验虽通过优化前处理方法减少了基质干扰,但仍有部分农药的基质效应较强(ME>1.2)。如,δ-六六六、α-硫丹、硫丹硫酸酯、p,p′-滴滴涕在5种畜禽肉中ME>1.24;艾氏剂、β-硫丹、狄氏剂在猪肉中ME>1.24;反式-氯丹、p,p′-滴滴滴在牛肉中ME>1.21;α-六六六、β-硫丹、反式-氯丹在羊肉中ME>1.31;α-六六六、艾氏剂、狄氏剂在鸡肉中ME>1.23;α-六六六、p,p′-滴滴滴在鸭肉中ME>1.31。因此,为克服基质效应和确保结果准确性,本试验最终采用基质匹配标准曲线法进行校正。

本试验用空白基质提取液配制成基质匹配混合标准、工作溶液,共设置7个浓度点,建立标准曲线。由表2可知:17种OCP在1～100 μg·kg-1内均呈现良好的线性关系(R2≥0.999 0),检测限为0.07～0.31 μg·kg-1,定量下限为0.23～1.03 μg·kg-1。

表1 17种OCP的保留时间、定性离子对、定量离子对及碰撞能量Table 1 Retention time(RT),qualitative ion pair,quantitative ion pair and collision energy of 17 OCP

2.4 方法的准确度与精密度

依据《食品中农药最大残留限量:GB 2763—2021》规定的畜禽肉中农药残留限量(10 μg·kg-1),分别选取限量、2倍限量及5倍限量对每种基质进行低、中、高3个水平(10、20、50 μg·kg-1)的加标回收试验。由表3可知:17种OCP的平均回收率为73.83%～116.40%,RSD为1.31%～8.56%。

2.5 实际样品的测定

为证实本方法的实际应用价值,选用30份市售生鲜畜禽肉作为供试材料,其中猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉各6份。由表4可知:在1份牛肉和羊肉中分别检出o,p′-滴滴涕(0.8、1.2 μg·kg-1),1份鸡肉中检出p,p′-滴滴滴(未超过本方法的定量下限)。

图5 17种OCP准溶液的二级质谱图Fig.5 Secondary mass spectrograms of 17 OCP standard solutions上行:定性离子;下行:定量离子。Up:Qualitative ions;Down:Quantitative ions.

表2 17种OCP的方法学验证分析Table 2 Methodological validation and analysis of the 17 OCP

续表2 Table 2 continued

表3 17种OCP的加标回收率和相对标准偏差(RSD)(n=6)Table 3 Recovery and RSD of 17 OCP(n=6)

续表3 Table 3 continued

表4 市售生鲜畜禽肉中OCP残留的检测结果Table 4 Detection results of OCP for municipal sold fresh livestock and poultry meats

本研究采用GC-MS/MS检测畜禽肉中17种OCP残留,所有检测目标物分离度较好,重现性好,并基于QuEChERS法对样品进行前处理,通过优化提取溶剂、萃取盐包、吸附剂用量,可有效降低基质干扰并提高待测物回收率。

本试验建立了一种QuEChERS结合GC-MS/MS检测畜禽肉中17种OCP残留的分析方法。17种OCP的检测限可达到0.07～0.31 μg·kg-1,低于国家现行有效标准《动物性食品中有机氯农药和拟除虫菊酯农药多组分残留量的测定:GB 5009.162—2008》和其他文献报道[30-31]。低、中、高3个浓度水平的加标回收率为73.83%～116.40%,RSD为1.31%～8.56%。方法的回收率和精密度符合《实验室质量控制规范 食品理化检测:GB/T 27404—2008》对回收率和精密度的要求。将该方法应用于实际畜禽肉样品的检测,达到较好的检测结果,可以满足市售畜禽肉中多种OCP残留的高通量快速检测,这对于加强畜禽肉在流通环节的追溯和监管,保障我国动物源食品安全具有重要意义。

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