李玉惠 王海生 邓秀玲

我国是肝癌高发国，全球每年新发病例中有一半发生在我国[1]。近年来我国在肝癌治疗方面逐步形成了以手术、介入治疗为主的综合模式[2]。但是由于肝癌起病隐匿，多数患者就诊时已发展至进展期或存在远处转移，导致治疗和预后不佳[3]。传统医药制剂治疗肿瘤时能在改善临床症状、缓解病情、减轻毒性不良反应、提高生存质量等方面发挥独特的作用，已成为近年研究的关注点。阿拉嘎-斑布是一种传统蒙药，其虫体的有效成分为斑蝥素(cantharidin，CTD)，抗癌功效在1980年由Chen等[4]首次发现，之后的研究证实CTD可以抑制肝癌、胃癌、乳腺癌等多种肿瘤的生长，但作用机制尚不明确，特别是从改善机体免疫功能角度研究CTD作用机制鲜见报道[5]。笔者课题组前期通过混合提取法从阿拉嘎-斑布虫体中提取到含量较高的斑蝥素，经高效液相与标准品鉴定其纯度为87.8%，同时观察到其在体外可抑制肝癌细胞的生长、侵袭、迁移[8]。因此，本研究拟从免疫检测点分子程序性死亡因子受体-1(programmed death receptor 1，PD-1)及其配体(programmed death-ligand 1,PD-L1)角度，探究阿拉嘎-斑布有效提取物斑蝥素抗肿瘤的免疫机制，为斑蝥素抗肿瘤机制的阐明及将阿拉嘎-斑布开发为蒙药成药用于临床抗肿瘤提供实验基础。

1.实验动物与细胞株：雄性BALB/c小鼠，体质量为20±2g，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司[许可证号：SCXK(京)2019-0010]。饲养于内蒙古医科大学动物实验中心SPF级鼠房，实验符合动物实验伦理规定。H22细胞株购自中国科学院细胞库(上海)，培养于1640培养基中，置于 37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。

2.药物：取前期经混合提取法提取的10mg CTD，加100ml PBS(含0.1% DMSO)后超声助溶3h后，配制成浓度为1mg/kg的原液，并稀释为0.5mg/kg、0.25mg/kg的工作液，分装后储存于4℃冰箱备用。

3.试剂：1640培养基(批号：8121074)、PBS(批号：8120335)购自美国Gibco公司；
5-氟尿嘧啶(批号：1209F021)购自北京Solarbio公司；
PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；
PCR试剂盒(批号：RR820A)购自日本TaKaRa公司；
PD-1(批号：ab228857)、PD-L1(批号：ab238697)兔抗鼠单克隆抗体购自英国Abcam公司；
缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)(批号：AF1009)、PI3K(批号：AF6241)、Akt(批号：AF6261)兔抗鼠单克隆抗体购自美国Affinity公司；
山羊抗兔荧光二抗(批号：A23920)购自美国Abbkine公司。

4.肝癌H22荷瘤鼠模型的建立：无菌环境下，在BALB/c小鼠的腹腔内注射鼠源性肝癌细胞株H22，当荷瘤小鼠腹部出现异常液体蓄积后，将其脱颈处死，无菌条件下取腹腔积液，离心，将细胞密度调节到1×107个/毫升，冰上备用。小鼠的右腋皮下经乙醇消毒后接种0.2ml细胞悬液，4～5天后健康小鼠腋下出现瘤体即为造模成功。

5.实验分组及给药：将荷瘤鼠随机分为空白组、模型组、5-FU组和CTD高、中、低剂量组。CTD高、中、低剂量组每日分别按1mg/kg、0.5mg/kg、0.25mg/kg剂量腹腔注射给药，5-FU组按25mg/kg每两天注射给药，模型组每日注射1次0.9% NaCl溶液；
给药周期为15天。空白组不给药。

6.小鼠体质量、肿瘤体积及抑瘤率的计算：分别于给药的第3、6、9、12、15天称重小鼠，记录体质量生长曲线；
用游标卡尺测量小鼠皮下肿瘤的长径(a) 和短径(b)，根据公式：V=ab2/2，计算肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线。给药结束后处死小鼠，剥取腋部皮下肿瘤组织，电子天平称取瘤质量，根据公式计算各组抑瘤率，抑瘤率(%)=(模型组平均瘤质量-给药组平均瘤质量)/模型组平均瘤质量×100%。

7.小鼠肿瘤组织病理学变化：将组织块脱水、透明后进行石蜡包埋，切片后行常规HE染色，中性树胶封片后镜检。

8.脾脏中PD-1 mRNA和肿瘤组织中PD-L1 mRNA表达水平的检测：按说明书方法提取组织RNA，测浓度和纯度后将mRNA反转录成cDNA。PD-1引物序列：上游引物：5′-GAGCTGGAAGCAAGGACGAC-3′,下游引物：5′-GTCCAGCTCCTCATAGGCCA-3′。PD-L1引物序列：上游引物：5′-CTGGACCTGCTTGCGTTAGTGG-3′,下游引物：5′-CCCCTGAAGTTGCTGTGCTGAG-3′。内参GAPDH引物序列：上游引物：5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′,下游引物：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。qPCR反应(20μl体系)：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 10μl，上游引物 0.8μl，下游引物 0.8μl，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4μl，cDNA 2.0μl，灭菌水6.0μl。反应条件：95℃变性30s；
40次循环：95℃ 3s、60℃ 30s；
程序默认熔解段。重复3次。PCR仪程序结束后，用2-△△Ct方法计算mRNA的相对表达量。

9.脾脏中PD-1、肿瘤组织中PD-L1、PI3K/Akt、HIF-1α蛋白表达水平的检测：提取组织总蛋白后进行蛋白定量、变性，常规电泳、转膜、封闭后一抗(PD-1:1∶2000，PD-L1:1∶1000，PI3K:1∶2000，Akt:1∶2000， HIF-1α:1∶2000，GAPDH:1∶5000)4℃过夜，二抗避光孵育后上机扫描条带并分析灰度值。目的蛋白/GAPDH代表因子的相对表达水平，每个样本重复3次。

1.斑蝥素对荷瘤鼠体质量的影响：各组小鼠给药期间体质量变化结果显示，空白组小鼠体质量增长趋势平稳；
与空白组比较，模型组小鼠体质量有明显增长，差异有统计学意义(P<0.05)，5-FU组小鼠体质量增加不明显(P>0.05)，CTD各剂量组小鼠体质量均有增加(P<0.05)；
与模型组比较，5-FU组和CTD高、中、低剂量组小鼠体质量明显降低，差异有统计学意义(P<0.05，表1，图1)。

图1 各组小鼠体质量变化曲线

表1 各组小鼠最终体质量

2.斑蝥素对荷瘤鼠肿瘤生长的影响：荷瘤鼠肿瘤生长结果如表2、图2所示，模型组小鼠肿瘤生长最快，体积、质量最大，与模型组比较，各给药组小鼠肿瘤生长稍缓，5-FU组小鼠肿瘤质量显著减小，差异有统计学意义(P<0.05)，对肿瘤的抑制率为45.09%，CTD各组中高剂量组对肿瘤抑制最显著，差异有统计学意义(P<0.05)，抑瘤率为38.96%，效果与5-FU最为相似。

表2 各实验组小鼠肿瘤体积、重量及抑瘤率

图2 各组小鼠肿瘤生长曲线

3.各组小鼠肿瘤病理学染色结果：各实验组小鼠瘤体组织结构的变化详见图3，通过显微镜观察到模型组肿瘤细胞数量多、分布均匀而紧密，细胞质少，偶有空泡，细胞核呈多形性且蓝染较深；
与模型组比较，5-FU组和CTD各剂量组肿瘤细胞数量明显减小，空泡数量增多，结缔组织增多，肿瘤细胞出现了不同程度的坏死和凋亡，CTD高剂量组较中、低剂量组更为明显。以上实验结果提示，斑蝥素对肝癌肿瘤的生长有抑制作用，以高剂量效果最优，故本研究后续实验采用斑蝥素剂量为高剂量(后续CTD组指CTD高剂量组)。

图3 各组小鼠瘤体组织(HE,×200)A.模型组；
B.5-FU组；
C.CTD高剂量组；
D.CTD中剂量组；
E.CTD低剂量组

4.斑蝥素对荷瘤鼠PD-1、PD-L1 mRNA表达的变化：与模型组比较，5-FU组和CTD组中PD-1 mRNA和PD-L1 mRNA的含量明显降低，差异有统计学意义(P<0.05，图4、图5)。

图4 小鼠PD-1及PD-L1mRNA熔解曲线A.PD-1熔解曲线；
B.PD-L1熔解曲线

图5 各组小鼠PD-1及PD-L1 mRNA表达情况与模型组比较，*P<0.05；
与5-FU组比较，#P<0.05

5.斑蝥素给药后PD-1、PD-L1、HIF-1α、PI3K/Akt蛋白表达的变化：与模型组比较，5-FU组和CTD组脾脏组织中PD-1蛋白的表达水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；
5-FU组和CTD组肿瘤组织中PD-L1蛋白表达较模型组明显减少，差异有统计学意义(P<0.05，图6)。与模型组比较，5-FU组和CTD组中PI3K蛋白的表达水平均显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；
5-FU组和CTD组中Akt蛋白的表达量较模型组明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)；
与模型组比较，5-FU组中HIF-1α蛋白的表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)；
CTD组HIF-1α蛋白的表达也有降低，差异有统计学意义(P<0.05，图7)。

图6 各组小鼠PD-1、PD-L1蛋白表达情况与模型组比较，*P<0.05；
与5-FU组比较，#P<0.05

图7 各组小鼠肿瘤组织中PI3K/AKT、HIF-1α蛋白表达情况与模型组比较，*P<0.05,**P<0.05;与5-FU组比较，#P<0.05

斑蝥是一种芫菁科昆虫，在蒙医药中称之为阿拉嘎-斑布，常被制成各种剂型用于治疗斑秃、面部软疣等疾病[9,10]。研究发现，斑蝥的有效成分斑蝥素具有抗肿瘤的作用，可能是通过调节控制炎症微环境、细胞增殖与程序性细胞死亡、血管生成渠道及细胞附着等方面来实现的[11～13]。斑蝥素的相关制剂已被临床用于肝癌的治疗，但其治疗肝癌的作用机制尚未明确。肿瘤发生、发展主要由免疫抑制和免疫逃逸导致，研究表明，免疫抑制和免疫逃逸与肿瘤细胞PD-L1的过表达密切相关[14]。PD-L1是机体T淋巴细胞活化的共抑制分子，在胃癌、乳腺癌等多种肿瘤组织中呈高表达状态[15～17]。肿瘤细胞表面的PD-L1能够与T细胞表面的PD-1结合，转导阻断性信号，使T细胞的活化受到抑制，增强肿瘤细胞的免疫耐受性，从而介导肿瘤细胞的免疫逃逸[18]。HIF-1α是PD-L1主要的上游调控因子，低氧状态下对PD-L1的表达有正向调节作用，使免疫细胞的活性下降，进而使肿瘤细胞逃避机体的免疫监视。

本研究通过观察斑蝥素对荷瘤鼠肿瘤生长的影响，发现模型组小鼠肿瘤生长迅速，体积增大最明显，斑蝥素对肝癌移植瘤生长具有一定的抑制作用，以高剂量的抑瘤效果最佳，抑制率为38.96%，与5-FU最为相似。各组肿瘤组织HE染色结果显示，模型组肿瘤细胞数量多、排列紧密、不规则，胞质少。与模型组比较，5-FU组和CTD各组肿瘤细胞数量减少，空泡及结缔组织增多，肿瘤细胞坏死数目增多，CTD各组里以高剂量组最为显著。考虑CTD可能通过诱导肿瘤细胞破裂来减少肿瘤细胞数量、导致肿瘤细胞死亡，且为本研究后续实验采用斑蝥素最佳剂量提供依据。

通过对荷瘤鼠脾脏PD-1和肿瘤组织PD-L1 mRNA及蛋白表达的检测，结果显示PD-1、PD-L1 在肝癌荷瘤鼠中呈高表达状态，这与文献报道相一致[19]。与模型组比较，经斑蝥素处理后的荷瘤鼠体内PD-1、PD-L1 mRNA及蛋白水平显著下降。PD-1/PD-L1通路上下游的HIF-1α、PI3K/Akt分子表达降低，提示一定剂量的斑蝥素对肝癌荷瘤鼠具有抗肿瘤免疫调节作用。考虑是肿瘤的发生使小鼠体内环境处于缺氧状态，从而高表达HIF-1α，促进肝癌细胞高表达PD-L1；
PD-1与PD-L1 结合，使PD-L1 胞质区的免疫受体酪氨酸转换基序(ITSM) 募集磷酸酶(SHP)-2，引起下游蛋白激酶PI3K 的去磷酸化，激活 PI3K/Akt通路，抑制T淋巴细胞和一些炎性细胞发挥免疫效应，使机体的自身防御机制出现异常甚至下降，进一步促进了肿瘤的发生、发展。而斑蝥素作用后PD-1、PD-L1、HIF-1α及PI3K/Akt的表达均下调，推测可能是斑蝥素通过下调HIF-1α的表达抑制了PD-1/PD-L1信号通路的发展，并阻碍PI3K/Akt的磷酸化过程，激活机体的自身防御机制，正向调节机体的免疫应答，抑制肿瘤细胞免疫逃逸的发生，从而发挥抗肿瘤作用。

综上所述，本研究初步观察到阿拉嘎斑布有效提取物斑蝥素可下调HIF-1α的表达，通过PD-1/PD-L1参与肝癌小鼠的免疫调节、抑制肿瘤生长，这为斑蝥素抗肿瘤机制的阐明及将阿拉嘎-斑布开发为蒙药成药用于临床抗肿瘤提供了一定的实验基础，但斑蝥素作用于PD-1/PD-L1和免疫系统的具体机制仍值得更深入的探讨。

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