罗 壮, 任 俊, 张沧源, 孙倩男, 4, 王 勇, 4, 马仪超1, , 王道荣1, , 4

(1. 扬州大学医学院, 江苏 扬州, 225001; 2. 扬州大学临床医学院 胃肠外科, 江苏 扬州, 225001; 3. 扬州大学-扬州市普通外科研究所, 江苏 扬州, 225001; 4. 江苏省扬州市消化病/代谢病基础与临床转化重点实验室, 江苏 扬州, 225001; 5. 江苏省淮安市中医院 肛肠科, 江苏 淮安, 223001)

结直肠癌(CRC)是常见的消化道恶性肿瘤，据最新的全球癌症流行病学统计报告[1]显示，结直肠癌发病率位居所有恶性肿瘤第3位，病死率居首位。中国结直肠癌发病率和病死率呈逐年增长态势[2-3]。研究[4]表明，基因调控异常是结直肠癌发生及发展的重要因素。胶原十二型α1链(COL12A1)作为一种编码Ⅻ型胶原蛋白α链的基因，是原纤维相关胶原蛋白家族的成员之一[5-7], 而Ⅻ型胶原蛋白则是细胞外基质(ECM)中重要的细胞支架及支撑蛋白[8-9]。JANUCHOWSKI R等[10]研究发现COL12A1在卵巢癌中呈高表达，并且与卵巢癌细胞的化疗耐药性有关。在肿瘤部位的适应性免疫反应所发挥的作用对于肿瘤侵袭和防御癌症之间的平衡至关重要，对这种免疫反应的评估可能有助于确定局部CRC和转移性CRC的预后及治疗[11]。研究[12]表明COL12A1在胰腺癌中表达升高，并且与不良预后有关，COL12A1可以作为胰腺癌的免疫标记物。本研究采用生物信息学分析、免疫组织化学(IHC)法及蛋白印迹法(WB)等手段探讨COL12A1在结肠癌中的作用及可能的生物学机制，现报告如下。

1.1 一般材料

收集2020年8月—2021年12月江苏省苏北人民医院胃肠外科手术切除的结肠癌及相应癌旁正常组织共47对，所有标本均经病理学确诊为首发结肠腺癌样本，术前未行放化疗，未合并其他肿瘤。由武汉塞维尔生物科技有限公司完成组织芯片微阵列的制作，提供每个芯片位点所对应的患者顺序并制作成组织芯片。根据国际抗癌联盟/美国癌症联合会(UICC/AJCC)第8版结直肠肿瘤TNM分期系统进行病理分期。本研究通过江苏省苏北人民医院医学伦理委员会的审核批准，患者均已签署同意书。

1.2 免疫组织化学染色及判断标准

将石蜡切片置于60 ℃烤箱中，冷却后用二甲苯及乙醇脱蜡; ddH2O冲洗后将切片放入柠檬酸钠缓冲液抗原修复; 再用磷酸液缓冲液漂洗; 组织上滴入内源性过氧化物酶阻断剂后，滴入山羊血清工作液，滴一抗B3GNT5(稀释1∶70), 4 ℃过夜; 于次日滴入生物素标记的山羊抗小鼠/兔IgG聚合物，滴辣根霉标记链霉卵白素工作液; 滴DAB显色液; 玻片浸入苏木精; 流水冲洗玻片; 梯度酒精脱水，封片。采用NDP. VIEW2软件观察图片，并进行扫描对比，根据染色强度和染色面积进行定量分析，由2名病理科医师独立阅片。染色强度无着色为0分，黄色为1分，棕黄色为2分; 阳性比率≤25%为1分, >25%～50%为2分, >50%～75%为3分, >75%为4分; 染色强度与阳性比率得分的乘积为最终得分, ≥4分为高表达[13]。

1.3 蛋白提取及WB检测

RIPA冰上裂解结肠癌细胞系HCT116、SW480和正常结肠黏膜细胞系NCM460, 持续15 min, 经离心后取蛋白上清保存。一部分上清利用BCA蛋白浓度试剂检测试剂盒确定浓度，步骤参照说明书; 剩余部分按比例加入5×蛋白上样缓冲液, 100 ℃煮沸5 min, 冷却后以30 μg/孔上样，经8%的SDS-PAGE电泳分离后，转印至PVDF膜后; 经5%的牛奶封闭1.5 h, 一抗4 ℃孵育过夜, TBST洗涤每次10 min, 共3次; 二抗孵育1 h, TBST洗涤每次10 min, 共3次; 进行化学发光显影，分析目的蛋白和GAPDH的吸光度(D)值，以目的蛋白与GAPDH的D值比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.4 数据库分析

从UCSCXena网站(https://xena.ucsc.edu/)下载肿瘤与癌症基因组图谱(TCGA)数据库中结肠腺癌(COAD)的转录组数据(HTSeq-FPKM数据)。排除部分样本: “0”基因表达值和缺失值。本研究共收集结肠癌组织458例和结肠正常组织41例，分析不同分组间COL12A1的表达差异。利用GEPIA和PrognoScan在线分析网站中的不同数据集来分析COL12A1表达与结直肠癌患者预后的关系。利用TIMER数据库分析COL12A1与免疫细胞浸润的关系。采用R软件进行基因本体论(GO)分析和京都基因和基因组百科全书(KEGG)分析，探讨COL12A1在结肠癌中发挥其生物学功能所依赖的相关信号通路。

1.5 统计学方法

采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。计量资料符合正态分布的，以均值±标准差表示; 若不符合正态分布，则采用中位数(四分位数)表示; 应用Mann-WhitneyU检验进行组间比较。计数资料采用Pearsonχ2检验进行评价和比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 数据库分析COL12A1基因在结肠癌组织中表达情况

基于TCGA数据库分析，泛癌表达分析结果显示COL12A1在胃癌、结肠癌、直肠癌等多种肿瘤中均呈高表达(图1A)。与相应正常组织比较，结肠癌组织样本中COL12A1基因表达水平呈高表达(图1B), 差异有统计学意义(P<0.001)。进一步分析COL12A1基因在不同分期结肠癌中的表达，除了Ⅳ期外，随着分期的升高,COL12A1基因表达水平逐渐升高(图1C), 且均高于正常组织表达水平。与普通腺癌比较，黏液腺癌中COL12A1基因表达水平更高(图1D)。以淋巴结转移个数进行分析，发生淋巴结转移的结肠癌组织中COL12A1基因表达水平较高(图1E)。临床蛋白质组学肿瘤分析协会(CPTAC)结肠癌数据库分析结果表明，结肠癌组织中COL12A1蛋白表达水平也高于正常组织(图1F)。

A: 泛癌分析结果表明COL12A1在胃癌、结直肠癌等多种肿瘤中呈高表达; B: TCGA数据库中COL12A1在结肠癌组织中表达高于正常结肠黏膜组织; C: 不同分期结肠癌组织中COL12A1表达均高于正常组织; D: 结肠腺癌、黏液腺癌组织中COL12A1表达均高于正常组织,且黏液腺癌中COL12A1表达高于腺癌组织; E: 有淋巴结转移的癌组织中COL12A1表达高于正常组织; F: CPTAC样本库结肠癌组织中COL12A1蛋白表达量高于正常组织。图1 TCGA数据库中COL12A1在结肠癌中的表达

2.2 COL12A1在结肠癌细胞系及结肠癌组织中的表达水平

WB检测正常结肠黏膜细胞系NCM460以及结肠癌细胞系SW480、HCT116中的表达水平，结果显示, 2种结肠癌细胞系中COL12A1均呈高表达(图2A)。47对结肠癌组织及相应正常组织样本的IHC分析结果显示, COL12A1在结肠癌组织中表达高于正常组织(图2B、2C), 差异有统计学意义(P<0.001)。

A: WB检测结果表明COL12A1在结肠癌细胞系中表达水平高于正常结肠黏膜细胞系NCM460; B: 47对结肠癌组织及正常组织芯片IHC染色典型结果; C: 47对结肠癌组织及正常组织芯片IHC染色结果。图2 COL12A1在结肠癌细胞系及组织样本中的表达

2.3 COL12A1对CRC患者预后的影响

本研究提取GEO数据库中GSE17536数据集及GSE14333数据集中的数据，采用不同COL12A1探针对CRC样本中的表达水平进行检测，并根据表达水平分为高表达COL12A1组与低表达COL12A1组。对2组患者进行生存分析，结果表明高表达COL12A1组中，患者总生存期(OS)、无病生存期(DFS)、疾病特异性生存期(DSS)均较低表达COL12A1组差，说明COL12A1表达越高，则患者预后越差(图3A、3B、3C)。利用GEPIA在线数据库分析TCGA数据库中COL12A1与结肠癌患者预后的关系，分别对OS及DFS进行分析，结果表明COL12A1表达水平与结肠癌患者OS无相关性(HR=1.5,P=0.093), 与DFS具有显著相关性(HR=1.7,P=0.027),提示结肠癌患者COL12A1表达越高，其DFS越短(图3D、3E)。

A、B: GSE17536数据库中不同探针检测COL12A1高表达与低表达的OS、DFS、DSS比较; C: GSE14333数据库中不同探针检测COL12A1高表达与低表达的DFS比较; D、E: GEPIA数据库中结肠癌患者COL12A1高表达与低表达的OS差异(P=0.093)与DFS差异(P=0.025)。图3 数据库中COL12A1表达与结肠癌患者预后的关系

2.4 COL12A1表达与结肠癌肿瘤微环境中免疫细胞浸润的关系

利用TIMER数据库在线分析TCGA数据库结肠肿瘤组织中COL12A1的表达水平，发现COL12A1与结肠癌免疫(R=0.35,P=1.7e-14)和基质(R=0.76,P<2.2e-16)评分存在正相关性。通过TIMER数据库网站观察COL12A1表达水平与结肠癌微环境中免疫细胞的关系，结果显示COL12A1与结肠癌的肿瘤纯度呈负相关(R=-0.314,P<0.001)。COL12A1与结肠癌中B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞的浸润水平均呈正相关(P<0.001), 其中与巨噬细胞(R=0.546)、中性粒细胞(R=0.535)、树突状细胞(R=0.52)关系最为密切。见图4。

A: COL12A1表达水平与结肠癌免疫评分呈正相关; B: COL12A1表达水平与结肠癌基质评分呈正相关; C: 通过TIMER数据库分析COL12A1表达与6种免疫细胞的相关性。图4 COL12A1与结肠癌肿瘤微环境免疫浸润之间的关系

2.5 COL12A1在结肠癌中下游信号通路的分析

利用TCGA下载相关的结肠癌数据，通过GSEA软件进行基因本体论(GO)、京都基因和基因组百科全书(KEGG)功能注释分析，研究与COL12A1共表达基因的生物学功能。结果显示，在COL12A1高的基因组中, GO功能主要涉及细胞黏附、化学突触传递、化学刺激、女性特征发展、多细胞信号等生物过程。KEGG分析结果表示, KEGG通路显著富集细胞因子受体相互作用、细胞质DNA感应途径、细胞基质受体相互作用、神经活性配体受体相互作用、嗅觉传导、自噬调节、RIG-I受体信号通路、系统性红斑狼疮、味觉传导。见图5。

A: 结肠癌中与COL12A1共表达的基因富集生物学功能(GO); B: COL12A1共表达的基因在结肠癌中富集的生物通路(KEGG)。图5 COL12A1共表达基因的功能和通路富集分析

2.6 结肠癌组织中COL12A1表达水平与患者临床病理特征的关系

根据47例结肠癌组织中COL12A1的IHC结果将其分为2组，免疫评分(IRS)≥4分为COL12A1高表达组, IRS<4分为COL12A1低表达组，结果显示COL12A1表达水平与神经/血管浸润(P=0.029)、淋巴结转移(P=0.003)、TNM分期(P=0.001)有关，与患者年龄、性别、肿瘤大小、分化程度、CEA、CA199表达水平无关(P>0.05)。见表1。

表1 COL12A1表达与结肠癌患者临床病理特征的关系

肿瘤微环境与肿瘤细胞之间存在着许多信息交换，微环境为癌细胞提供了有利条件，促进了癌细胞的增殖和转移。ECM是肿瘤微环境中最丰富的成分之一。ECM中胶原蛋白的表达异常已在多种癌症中报道[14], 胶原家族的重要成员Ⅰ型胶原是ECM的关键结构成分, Ⅻ型胶原蛋白为细胞外基质中最重要的结构类蛋白，是与Ⅰ型胶原蛋白相关的同种三聚体，这种关联被认为可以改变胶原蛋白Ⅰ原纤维与周围基质间的相互作用，在肿瘤微环境的整体调控中发挥了重要意义[5, 15-16]。

研究[17]发现在食管鳞癌中，甲基转移酶样3(METTL3)通过COL12A1介导的RAF/MER/ERK/MAPK信号通路，调节食管鳞癌的增殖及转移能力，一定程度上揭示了COL12A1上游的调控机制及其参与的肿瘤调控通路。COL12A1在胰腺癌中高表达，并且与患者的不良预后有关，其中NAMPTP1/HCG11-hsa-miR-26b-5p-COL12A1信号轴可能是调控胰腺癌不良预后的关键信号通路，但本研究只涉及了基因网络调控层面，并未进行详细的实验验证[18]。本研究首先通过TCGA及CPTAC数据库对COL12A1在结肠癌中的表达情况进行了生物信息学分析，结果表明COL12A1在结肠癌中的基因及蛋白表达水平均显著高于正常结肠黏膜组织，说明该基因在结肠癌组织中被异常激活; 随后通过IHC及WB的方法检测了细胞系及本中心临床样本中COL12A1表达情况，结果表明其在结肠癌细胞系中表达显著高于正常细胞，并且本中心样本研究结果也与数据库中COL12A1表达趋势相同，其在结肠癌样本中的蛋白表达水平明显高于正常组织。上述结果表明, COL12A1在结肠癌组织及细胞系中表达均明显升高。然而, COL12A1在结肠癌中高表达的意义及作用尚不明确。本研究进一步对COL12A1与结肠癌预后的相关性进行分析，结果表明COL12A1表达越高的患者预后越差; 临床病理特征的相关性分析结果表明, COL12A1表达水平与神经/血管浸润(P=0.029)、淋巴结转移(P=0.003)、TNM分期(P=0.001)有关，证实了COL12A1在结肠癌中的表达与恶性生物学行为呈正相关。

本研究还对COL12A1的表达与结肠癌免疫浸润水平进行了分析，在结肠癌中, COL12A1的表达与巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、B 细胞的浸润水平均呈正相关，相关性程度由强到弱，其中与巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞相关性最明显，与CD4+T细胞的相关性较与CD8+T细胞的相关性更强。进一步分析发现, COL12A1的高表达提升了M2型巨噬细胞表达，而浸润在肿瘤微环境中的巨噬细胞一旦转变为M2型，即可募集并表达细胞因子和趋化因子，进而成为肿瘤发展的关键驱动因素[19]。在结直肠癌中，M2型巨噬细胞数量比M1型多，不仅抑制抗肿瘤免疫[20], 其衍生的外泌体还可诱导结肠癌细胞侵袭与迁移[21], 提示M2型巨噬细胞与结直肠癌密切相关。COL12A1的表达与结肠癌基质评分及免疫评分水平具有相关性，而免疫评分是T细胞浸润肿瘤的直接衡量标准，因此任何直接或间接影响该过程的机制也会影响免疫评分类别，免疫评分测量的宿主免疫反应在无病生存期方面优于金标准TNM分类[22]。本研究还对COL12A1在结肠癌中的可能机制进行了初步探讨，结果表明在COL12A1高表达组中GO功能主要涉及细胞黏附、化学突触传递等生物过程; KEGG通路显著富集细胞因子受体相互作用、细胞基质受体相互作用等，而COL12A1本身就是一种编码Ⅻ型胶原蛋白α链的基因，其在细胞间黏附、细胞间信息传递中发挥重要作用。

本研究的不足: ① 仅初步探讨了COL12A1的临床意义及可能的作用机制，其具体在结肠癌中影响细胞增殖或者转移等表型尚缺乏实验依据; ② COL12A1的确切下游作用靶点也尚未明确，需更更深入的研究。

综上所述, COL12A1在结肠癌中表达升高，其高表达与患者预后不良相关，高表达的COL12A1可以激活一系列癌症相关通路，从而导致肿瘤进展, COL12A1或可作为结肠癌患者的预后生物标志物。

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