刘宇航 申东晨 王思涵 马千雯 林辉 钟鹏 董爱荣

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

红皮云杉(PiceakoraiensisNakai)是松科(Pinaceae)云杉属(Picea)的一种珍贵树种，为常绿乔木，树高可达到30m以上，树皮呈现淡红褐色或灰褐色。红皮云杉不仅分布于黑龙江、吉林、辽宁和内蒙古等地区，在朝鲜的北部及俄罗斯远东部分地区也有分布，而且适应性较强，能在不同类型的立地条件下正常生长，能够生长在海拔400～1 800 m的地带[1-2]。红皮云杉木材淡黄褐色，树干笔直，质地较软，耐腐蚀性能比较弱，可用作建筑、高档家具和造纸的原料，也是东北地区的主要绿化树种，具有观赏价值和经济价值[3-8]。

红皮云杉的梢枯病对于树种的危害极大，致病病原菌为寄生小穴壳(Dothiorellagregaria)，寄生小穴壳病害在世界范围内均有分布[9-11]。寄生小穴壳于1979年在杨树水泡型溃疡病的鉴定发现，并描述了寄生小穴壳的形态特征与生长特性，后验证出可以引起梢枯病[9，12]。梢枯病病害发生部位为云杉的嫩梢，发病后，嫩梢干枯，针叶顶部会开始弯曲并且下垂，仅剩下一小簇针叶残留在枝梢顶部，发病严重时整株云杉死亡。对梢枯病的防治我国目前主要使用物理防治和化学防治，但是这两种防治方法均有比较明显的劣势。目前国内外对运用植物内生菌拮抗病原菌防治梢枯病进行了研究[13-15]；
高通量测序能够更为准确快捷了解微生物的性质及其在自然界中的生态功能，通过高通量测序技术能够一次性检测出样品中可能感染的多种病原物基因组序列，对病原检测鉴定具有很好的应用前景[16-18]。关于红皮云杉梢枯病的研究鲜有报道，而对其生物防治技术方面的报道，更是微乎其微。本研究基于高通量测序技术分析感云杉梢枯病前后叶围微生物多样性以及群落结构的变化探知优势微生物的分布，从而指导筛选云杉叶片叶围优势的梢枯病拮抗菌。

1.1 试验材料

健康红皮云杉(Piceakoraiensis)、发病红皮云杉叶片均采自黑龙江省哈尔滨市东北林业大学校园内。2021年7月18日，采用“S”形十点采样法，分别剪取10棵28年生健康及感梢枯病红皮云杉针叶。分别从10棵树上采集的样品中选取1.0 g，用无菌剪刀剪碎后，将其混匀。分别得到10.0 g健康样品及10.0 g感病样品，D1表示健康样品，D2表示感病样品。

1.2 红皮云杉叶围微生物基因组DNA的提取及检测

红皮云杉样品的基因组DNA参照MP试剂盒(Fast DNA Spin Kit for Soil 116560-200)的使用说明书进行提取，将所提取到的DNA溶于50 μL无菌水中，混合均匀，置于-80 ℃保存备用。使用Nano Drop2000进行基因组DNA浓度及纯度检测，使用琼脂糖凝胶电泳进行基因组DNA完整性检测。基因组DNA浓度、纯度检测待DNA完全溶解后，将TE缓冲液设为空白对照，移取2 μL，使用超微量紫外可见分光光度计检测其浓度，并根据D260/D280的值检测其纯度。基因组DNA完整性检测根据浓度检测结果，先将样品放置于冰上进行融化，之后将其充分混匀并离心，移取3 μL DNA样品进行检测，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测，电压为130 V，电泳时间为20 min，在凝胶成像系统上拍照观察分析DNA样品的完整性[19]。

1.3 16SrDNA荧光定量PCR扩增和高通量测序

利用2%琼脂糖凝胶检测提取的DNA的质量，并将其送至上海美吉生物医药科技有限公司进行高通量测序，应用Miseq平台进行数据分析。

1.4 数据处理

真菌ITS选择ITS1和ITS2R作为引物，分别为5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’和5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’；
细菌16SrRNA选择799F和1193R作为引物，引物序列分别为5’-AACMGGATTAGATACCCKG-3’和5’-ACGTCATCCCCACCTTCC-3’；
利用IlluminaMiSeq平台进行测序和分析。

数据经过QIIME(v1.8.0)软件过滤、拼接、去除嵌合体，去除各样本中读长(reads)尾部质量值在20以下的碱基、切除reads中含N部分序列，并去除数据中的短序列(长度阈值200 bp)，随后再对低复杂度的序列进行过滤。采用Usearch(v7．1)软件进行数据处理，物种比对注释使用RDP classifier软件，保留置信区间大于0.8的注释结果。利用Mothur软件进行Chao1指数、辛普森(Simpson)指数、覆盖度(Coverage)指数计算分析，并在各分类水平上进行群落结构的统计分析，得到微生物群落结构组成。

2.1 感病前后样品的细菌和真菌多样性

阿尔法(Alpha)多样性指数可用来反映生物群落的丰富度和多样性。其中，Chao1指数可反映生物物种的丰富度，其数值越大表示该样品物种丰富度越大，Chao1指数用来估计样本中所含OTU数目的指数；
香农(Shannon)多样性指数是一种基于信息理论的测量指数，反映生物群落的多样性和衡量群落的异质性，其数值越大表示群落多样性越高；
测序深度(Coverage)指数则可以反映生物群落的覆盖度，其数值越高，则样本中序列被测出的概率越高，该指数反映本次测序结果是否代表了样本中微生物的真实情况[20]。

由表1可知，感病前后分别检测到260、64个细菌OTU，165、157个真菌OTU；
样品D2中细菌的OTU数目、Shannon指数和Chao1指数都明显下降，D2中真菌的OTU数、Shannon指数和Chao1指数都小幅下降。说明感病后，病原菌占绝对优势，且对其他微生物产生一定的抑制作用，细菌、真菌多样性及物种总数显著下降。所有样品的覆盖度(coverage)指数均超过0.998 6，表明细菌及真菌的测序深度已达到较高水平，数据可靠。

表1 感病前后红皮云杉样品的细菌和真菌多样性指数

由图1可知，感病前后样品共含有279个细菌OTU，两组样品共有的细菌种类仅有45个，占细菌总数的16.13%，说明红皮云杉感染梢枯病菌前后，叶围细菌发生了极大的改变。感病前后样品共含有249个真菌OTU，两组样品共有的真菌种类仅有73个，占真菌总数的29.32%，说明红皮云杉感染梢枯病菌前后，叶围真菌发生了巨大的变化。

图1 感病前后红皮云杉样品真菌和细菌OTU分布韦恩图

2.2 感病前后样品的细菌群落结构差异性

由表2可知，从细菌分类门的水平看，两个样品主要含有4个门的细菌，包括变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteriota)、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidota)。

表2 感病前后红皮云杉样品细菌群落结构分布

在门水平下，感病前后样品中的细菌群落结构组成大致相同，两组样品都含有以上4个门的细菌，而D1样品中主要含有变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteriota)、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidota)，丰度分别为69.94%、12.85%、10.54%和4.11%，三者合计高达97.44%，未鉴定的细菌丰度为2.56%。D2样品主要含有变形菌门这一个门，丰度高达99.56%，其他门以及未鉴定的细菌丰度均在0.33%以下。结果红皮云杉感染云杉梢枯病后，细菌群落结构组成未发生较大的变化，变形菌门丰度大幅度上升，放线菌门、厚壁菌门和拟杆菌门丰度均发生大幅度下降，而其他细菌门丰度也发生了大幅度下降。

根据物种分类结果，由于样品中所检测出的细菌种类繁多，许多物种丰度极低，因此筛选出优势物种，对细菌平均丰度前15的物种进行分类统计并将在两组样品中丰度均小于1%的物种合并至其他类别。从细菌分类属水平看，两样品丰度前15个属的细菌主要包括：马赛菌属(Massilia)、克雷伯菌属(Klebsiella)、青枯菌属(Ralstonia)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、贪噬菌属(Variovorax)、假单胞菌属(Pseudomonas)、拟杆菌属(Bacteroides)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、Robbsia属、动球菌属(Kineococcus)、链球菌属(Streptococcus)、布劳特氏菌属(Blautia)、志贺氏菌属(Escherichia-Shigella)、纺锤链杆属(Fusicatenibacter)和未被鉴定的放线菌纲(Gaiellales)。

在属水平下，两组样品中的细菌群落结构组成不尽相同，且相对丰度的差异也较大。D1中克雷伯菌属、青枯菌属、鞘氨醇单胞菌属、贪噬菌属、假单胞菌属、拟杆菌属、甲基杆菌属、动球菌属、链球菌属、布劳特氏菌属、志贺氏菌属、纺锤链杆属和未被鉴定的放线菌纲的丰度均高于D2组，其中，青枯菌属、拟杆菌属、链球菌属、布劳特氏菌属和纺锤链杆属等仅存在于D1组；
而D2中马赛菌属丰度占据绝对优势，丰度高达93.95%，其余优势属只有两个，分别为鞘氨醇单胞菌属与Robbsia属，丰度分别为1.25%和1.51%，除了马赛菌属外，只有Robbsia属的丰度高于D1组，其中，克雷伯菌属、志贺氏菌属、未被鉴定的放线菌纲这三种属在D2中仅占0.01%并且D2中没有特有菌属。

2.3 感病前后样品的真菌群落结构差异性

由表3可知，从真菌分类门水平看，两组样品主要含有3个门的真菌，即：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、无法确定的真菌(unclassified_k_Fungi)。在门水平下，感病前后样品中的真菌群落结构组成基本相同，差异较大的是相对丰度。这说明2组样品中群落结构未发生根本改变。子囊菌门是两组样品中的优势真菌，其中，D1样品的丰度(85.04%)略大于D2样品的丰度(55.44%)。其次是担子菌门和无法确定的真菌，在D1样品中其他类别的真菌丰度为0.35%，在D2样品中无其他类别的真菌。

表3 感病前后红皮云杉样品真菌群落结构分布

根据物种分类结果，由于样品中所检测出的真菌种类繁多，许多物种丰度极低，因此筛选出优势物种，并对优势真菌进行分类统计。从真菌分类属水平看，两组样品平均丰度前20个属的真菌包括:亚隔孢壳属(Didymella)、穴壳菌属(Dothiorella)、线黑粉菌属(Filobasidium)、Naganishia属、Kwoniella属、短梗霉属(Aureobasidium)、外囊菌属(Taphrina)、未被鉴定的亚隔孢壳科(Didymellaceae)、枝孢属(Cladosporium)、Papiliotrema属、Sclerostagonospora属、担孢酵母属(Erythrobasidium)、新刺毛茎点霉属(Neosetophoma)、Knufia属、附球菌属(Epicoccum)、赤霉菌属(Gibberella)、红冬孢酵母属(Rhodosporidiobolus)、未被鉴定的真菌(unclassified_k_Fungi)、Dothidea属、未被鉴定的锤舌菌纲(Leotiomycetes)、Genolevuria属。

在属水平下，两组样品中的真菌群落结构组成基本相同，差异较大的是相对丰度。D1中亚隔孢壳属、外囊菌属、枝孢属、Sclerostagonospora属、担孢酵母属、新刺毛茎点霉属、Knufia属、附球菌属、赤霉菌属、红冬孢酵母属、未被鉴定的真菌、Dothidea属、未被鉴定的锤舌菌纲、Genolevuria属丰度高于D2组，其中，Knufia属、赤霉菌属和未被鉴定的锤舌菌纲仅存在于D1组；
而D2中穴壳菌属、线黑粉菌属、Naganishia属、Kwoniella属、短梗霉属、未被鉴定的亚隔孢壳科和Papiliotrema属等的丰度高于D1组，其中，穴壳菌属及Naganishia属仅存在于D2组。

本研究通过IlluminaMiSeq测序平台，分析了红皮云杉健康叶和感梢枯病叶的叶围微生物的群落结构，以及两者之间共生细菌和真菌群落结构的差异。红皮云杉感梢枯病叶与健康叶相比，细菌、真菌的多样性及物种总数都显著下降，在门及属水平上差异都较为显著。相较于放线菌门、厚壁菌门和拟杆菌门，变形菌门在红皮云杉健康叶和感梢枯病叶的细菌群落结构组成中占显著优势；
在两者的真菌群落结构中，子囊菌门占据绝对优势。

在叶围微生物的研究中，分别发现了45个属的细菌和73个属的真菌。马赛菌属在病叶的细菌群落中占据绝对优势，杨恩东等[21]发现马赛菌属目前包含43个有效描述种，该菌群在土壤环境中广泛分布，并未作为致病病原细菌被发现且该菌具有溶磷作用。而本次研究显示在病叶中马赛菌属的相对丰度占据绝对优势且高达93.95%，故在病叶中细菌种类及多样性的减少是由于真菌病原菌的影响。通过分析真菌群落，发现穴壳菌属仅存在于病叶之中，云杉梢枯病病原为寄生小穴壳(D.gregaria)[9]，与本研究的结果刚好对应。在云杉内生优势细菌中，克雷伯菌属(Klebsiella)及假单胞菌属(Pseudomonas)这两属细菌在不同程度上具有抑制不同真菌病原菌的能力[22]；
而在云杉内生优势真菌中，未发现具有抑制真菌病原菌能力的真菌。

红皮云杉发生云杉梢枯病后，感梢枯病病叶与健康叶相比，细菌、真菌的多样性及物种总数都显著下降，在门及属水平上差异都较为显著；
病叶与健康叶在门与属水平上的具体差异，确定了穴壳菌属会导致红皮云杉的云杉梢枯病，确定了两属极可能拮抗穴壳菌属的内生细菌为克雷伯菌属及假单胞菌属。

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