林梦姣，刘德果，赵姣，苏艺峰，向时竹，陈其华

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；
2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是威胁男性身心健康的恶性肿瘤，随着生活方式的转变，我国PCa 患者发病率正逐步提高，并呈现老年多于青中年、城市多于农村的发病特点［1］。PCa 出现临床症状时多数已达到晚期，预后较差。雄激素剥夺治疗是目前公认的晚期PCa 治法，但因其有效期短、副作用多、易耐药性等不足，临床难以取得较好的疗效［2−3］。

益肾通癃汤是湖南中医药大学第一附属医院陈其华教授经验方，近20 年的临床应用表明其能有效缓解PCa 患者临床症状，团队相关实验表明其能降低炎性指标水平，减轻化疗药物毒副作用［4］，但其具体机制仍需进一步证实。

现代研究表明，氧化应激与PCa 的发生和发展息息相关，参与PCa进程［5］。基于PCa细胞大量增殖及侵袭的特点，其生命活动需要一定量的活性氧（ROS）维持，当大量的ROS 蓄积在胞浆中，诱导产生严重的氧化应激反应［6］，便可通过细胞凋亡［7−8］、上皮－间质转化［9］、雄激素受体信号再激活等途径造成癌细胞凋亡［10−11］。而核因子红细胞2相关因子2（Nrf－2）和超氧化物歧化酶1（SOD1）作为两种主要的保护因子参与其中。PCa 细胞可通过两种因子的释放降低氧化应激反应，从而减少凋亡的发生。

本研究旨在探讨益肾通癃汤产生临床疗效的机制，观察其是否与通过下调Nrf－2、SOD1 的表达以诱导PCa细胞产生高度氧化应激反应有关。

1.1 实验材料

1.1.1 实验细胞株

PC－3 细胞株购自中国科学院细胞库，在湖南中医药大学中医诊断湖南省重点实验室长期冻存。

1.1.2 实验动物

SPF 级雄性BALB/c 裸鼠40 只，体质量20～22 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK（湘）2019－0004，动物使用许可证号：SYXK（湘）2019－0009。饲养于湖南中医药大学医学创新实验中心SPF 动物房，饲以SPF 级颗粒饲料并自由饮水，动物房自然采光，相对湿度为50%～75%，温度为22～24 ℃。本实验已通过伦理审查，伦理批号：

LBH－20201011000。

1.1.3 实验药物

益肾通癃汤组方：补骨脂15 g，熟地黄15 g，黄芪30 g，三棱10 g 和莪术10 g；
均购于湖南中医药大学第一附属医院中药房，加适量蒸馏水两次煎煮共50 min，将药液浓缩至每1 mL 药液含生药量1.44 g。其中益肾通癃汤中剂量组为益肾通癃汤原方剂量折算后剂量（相当于成人等效剂量，即每1 mL 药液含生药量1.44 g），益肾通癃汤高剂量组相当于成人等效剂量的2 倍，益肾通癃汤低剂量组相当于成人等效剂量0.5倍。

1.1.4 主要试剂与设备

F12/DMEM 1∶1 培养基、胎牛血清、PBS（Hyclone 公司）；
胰蛋白酶（南京吉诺环境科技有限公司）；
ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司）；
Trizol（美国Thermo）；
mRNA 逆转录试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）；
EDTA（中国大连美伦生物技术有限公司）；
Nrf－2、SOD1 抗体及相应二抗（美国proteintech）；
DYY－6C 恒温箱（北京六一生物科技有限公司）；
BA210T显微镜（Motic）；
PIKOREAL96荧光定量RCP仪（美国Thermo）；
DYY－2C电泳仪（北京六一生物科技有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及PCa裸鼠模型建立

制备前列腺癌PC－3 细胞悬液，使其密度为1 × 106/mL，BALB/c 裸鼠腹股沟消毒，并在消毒部位接种0.1 mL 上述细胞混合液，1 周后部分裸鼠可触及粟粒样大小的瘤体，接种2 周后，裸鼠皮下可见长径约3 mm 的瘤体，即为动物肿瘤模型建立成功，40 只裸鼠均造模成功。

1.2.2 动物分组及给药

造模成功后，将40 只裸鼠随机分成4 组，分别为模型组，益肾通癃汤低、中、高剂量组（以下简称低、中、高剂量组），每组10 只。模型组灌胃生理盐水［1 mL/（100 g·d）］，益肾通癃汤各剂量组分别灌胃0.72、1.44、2.88 g/mL生药量的益肾通癃汤［1 mL/（100 g·d）］，给药时间21 d。末次给药后12 h，摘取眼球取血，脱颈处死裸鼠，完整剥离瘤体，称取瘤重，并计算抑瘤率。

抑瘤率（%）=（1－实验组平均瘤重/模型组平均瘤重）× 100%

1.3 检测方法

1.3.1 HE染色观察肿瘤组织病理改变

经过烤片、切片脱蜡、苏木素染1～5 min、伊红染色1 s、脱水、树胶封片等步骤得到成片，镜下观察并拍照。

1.3.2 ELISA检测Nrf－2、SOD1含量

取4 组裸鼠血液离心制备血清，严格按ELISA 试剂盒说明书进行操作，检测Nrf－2、SOD1含量。

1.3.3 Western blot法检测Nrf－2、SOD1蛋白表达

提取组织蛋白，离心后取上清煮沸后速冷。经过电泳、上样、转膜后添加Nrf－2、SOD1抗体，一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育90 min显影冲洗。将曝光后的底片扫描，并用Quantity one专业灰度分析软件进行分析。

1.3.4 RT－PCR检测Nrf－2、SOD1 mRNA表达

各取4 组小鼠各25 mg 瘤体组织，使用Trizol 裂解样品，提取细胞总RNA，逆转录cDNA，采用SYBR 法进行PCR 扩增，PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像系统观察，引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.4 统计学方法

本研究采用SPSS 25.0 统计软件进行数据统计学分析。计量资料以±s表示，组间比较采用方差分析。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2.1 各组裸鼠抑瘤率比较

结果显示，各组抑瘤率具有显著差异，且抑瘤率随药物浓度的上升而增高，呈剂量依赖性。见表2。

表2 各组抑瘤率比较

2.2 HE染色观察瘤体病理改变

模型组中可见大量PCa 细胞核分裂象，而益肾通癃汤高剂量组中可见细胞核裂解，裂解程度高剂量组明显大于低、中剂量组，但低、中剂量组较模型组细胞核裂解象未见明显差异。见图1。

图1 各组瘤体组织病理变化（HE，× 100）

2.3 移植瘤中Nrf－2、SOD1含量比较

ELISA 结果显示，与模型组比较，益肾通癃汤低、中、高剂量组可降低PCa裸鼠瘤体组织中Nrf－2、SOD1的含量（P＜ 0.01），并呈剂量依赖性，即药物浓度越高，Nrf－2、SOD1含量越低。见表3。

表3 各组瘤体中Nrf－2、SOD1含量比较（±s）

表3 各组瘤体中Nrf－2、SOD1含量比较（±s）

注：与模型组比较，aP ＜ 0.01；
与低剂量组比较，bP ＜ 0.01；
与中剂量组比较，cP ＜ 0.01。

2.4 移植瘤中Nrf－2、SOD1蛋白表达

Western blot 结果显示，与模型组比较，益肾通癃汤干预能降低移植瘤中Nrf－2、SOD1 蛋白的表达（P＜ 0.01），并随着浓度升高，降低幅度增大，见表4和图2。

图2 各组Western blot印迹结果

表4 各组瘤体中Nrf－2、SOD1蛋白表达比较（±s）

表4 各组瘤体中Nrf－2、SOD1蛋白表达比较（±s）

注：与模型组比较，aP ＜ 0.01；
与低剂量组比较，bP ＜ 0.01；
与中剂量组比较，cP ＜ 0.01。

2.5 移植瘤中Nrf－2、SOD1 mRNA的表达

RT－PCR 结果显示，与模型组比较，益肾通癃汤低、中、高剂量组PCa 裸鼠瘤体组织中Nrf－2、SOD1 mRNA 表达显著下调（P＜ 0.01），且药物浓度越高，下调幅度越大。见表5。

表5 各组瘤体中Nrf－2、SOD1 mRNA的表达比较（±s）

表5 各组瘤体中Nrf－2、SOD1 mRNA的表达比较（±s）

注：与模型组比较，aP ＜ 0.01；
与低剂量组比较，bP ＜ 0.01；
与中剂量组比较，cP ＜ 0.05，dP ＜ 0.01。

本课题组前期研究发现，益肾通癃汤能够有效抑制前列腺组织微血管生成及血清中雌/雄激素的比例失衡，调节COX－2及PGE－2表达，降低炎性反应程度［12］，影响HIF－1α 的表达有效抑制新生血管形成［13］。本研究发现，其能够明显抑制PCa瘤体的生长，且抑瘤率随药物浓度的上升而增强；
镜下观察HE染色显示，益肾通癃汤干预能够促进PCa细胞核裂解，引起细胞凋亡。

在荷瘤状态下，Nrf－2 作为肿瘤细胞的保护因子被释放，通过Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Keap1）－核因子红细胞2 相关因子2（Nrf－2）/抗氧化反应元件（ARE）通路减轻氧化应激对肿瘤细胞的有害反应，并可对化疗药物起到增毒减效的效果［14］。氧化应激产生的氧自由基不能被肿瘤细胞清除，SOD1可将氧自由基歧化为H2O2，再进一步被机体清除［15］，达到抗氧化的目的，延缓癌细胞凋亡，最终导致疾病进展。本实验中PCR、ELISA、Western blot 结果均显示，益肾通癃汤干预可明显下调Nrf－2 及SOD1 表达，说明益肾通癃汤可能是通过抑制Nrf－2、SOD1 的表达，诱导癌细胞氧化应激反应，促进肿瘤细胞凋亡，减小肿瘤体积，从而达到对PCa的治疗作用。

益肾通癃汤组方中补骨脂、熟地黄、黄芪、三棱和莪术，其单体药物已被现代诸多研究证实有效成分具有抗肿瘤的活性［16−20］，且有效活性成分不止一种，但均以中药单体为主进行实验研究。中药配伍是中医辨证论治的一大特色，通过配伍使药物减毒增效是根本目的，在单体实验中有效的活性成分经过配伍之后是否具有相同的抗癌活性甚至更高是现代中药复方研究的热点与难点。本研究目前的实验设计仅能证实益肾通窿汤可通过下调Nrf－2、SOD1表达达到治疗PCa的目的，但此中药复方中主要抗癌活性成分、活性与剂量相关关系、五味中药的配伍是否使抗癌效果最大化等问题尚不明确，仍需要团队进一步实验证实，为临床指导用药提供理论依据。

综上所述，益肾通癃汤可有效治疗PCa，其机制可能与下调Nrf－2、SOD1 的表达有关，但其有效成分需进一步研究证实。

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