葛曙雄 王 辉 许中友 （宁波大学附属人民医院血管外科，宁波 315000）

近年来，随着生活方式和饮食习惯的改变，由动脉粥样硬化引起的心脑血管疾病的发病率和病死率在逐年升高，成为了全球人口死亡的主要原因［1］。内皮细胞功能障碍被认为是动脉粥样硬化发生的起始环节，它主要是由氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）引起的［2］。ox-LDL可破坏血管内皮细胞的氧化还原平衡，诱导内皮细胞凋亡［3］。此外，动脉粥样硬化损伤内皮后，会改变内皮细胞表型，使其获得间质细胞表型，称为内皮间质转化（endothelial-mesenchymal transition，EndMT）［4］。最近越来越多的研究显示EndMT在动脉粥样硬化的发生和发展过程中具有重要作用［4-5］。组织蛋白酶S（cathepsin S，CTSS）是一个能够促进炎症性疾病的溶酶体蛋白酶，研究发现CTSS可调控内皮细胞的功能，如下调CTSS可引起缺氧诱导的内皮细胞侵袭、增殖和管腔形成受损，造成血管生成能力减弱，这与过氧化物酶体增殖物激活受体γ和血管内皮生长因子表达水平减少以及Akt、ERK1/2、p38 MAPK通路被抑制有关［6］。CTSS还可通过蛋白酶激活受体2选择性地破坏肾小球内皮细胞的完整性和屏障功能［7］。文献显示CTSS在动脉粥样硬化组织和血清中高表达，具有高水平CTSS的患者颈动脉内中膜厚度越厚，血糖和血脂水平较高，但是一氧化氮水平较低［8-9］。在LDL受体缺陷型小鼠中敲除CTSS明显降低了斑块面积和内膜厚度以及脂质积累［10］。这些研究提示CTSS可能与动脉粥样硬化中内皮损伤有一定联系。但是目前CTSS对动脉硬化过程中内皮细胞损伤的作用及可能的机制尚未见相关报道。因此，本研究使用ox-LDL刺激人脐静脉内皮细胞（human umbilical vascular endothelial cells，HUVECs）模拟内皮细胞损伤，通过siRNA干扰技术下调CTSS，探究CTSS对内皮细胞损伤和EndMT的影响和机制。

1.1 材料 HUVECs细胞为美国ATCC产品；
DMEM高糖培养基为美国Hyclone公司产品；
胰酶和双抗为美国Gibco公司产品；
ox-LDL和RIPA裂解液为北京索莱宝生物科技有限公司产品；
胎牛血清为美国Invitrogen公司产品；
CCK-8试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒和Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒为上海碧云天生物技术研究所产品；
人IL-1β和TNF-α ELISA试剂盒为杭州联科生物公司产品；
重组Anti-Cathepsin S抗体（ab134157）、重组Anti-CD31抗 体（ab76533）、Anti-Vimentin抗 体（ab16700）为Abcam公司产品；
VE-Cadherin兔单克隆抗体（#2158）、α-Smooth Muscle Actin兔单克隆抗体（#19245）、Phospho-p38 MAPK（Thr180/Tyr182）兔单克隆抗体（#4511）、p38 MAPK兔单克隆抗体（#8690）为美国Cell Signaling Technology公司产品；
GAPDH兔多克隆抗体为武汉博士德生物工程有限公司产品；
茴香霉素（Anisomycin，AM）为美国Selleck公司产品；
CTSS siRNA序列5"-CAGCCAGTGGCAGAGAAATATCACA-3"，对照siRNA序列5"-CAGGTGAGACGAAGATATACCCACA-3"，序列由上海吉玛生物有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和分组处理 将胰酶消化的对数生长期的HUVECs细胞接种到细胞培养板中，加入含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素的DMEM培养基，然后置于37 ℃含5%CO2的细胞培养箱中培养。细胞贴壁后，将细胞分成4组：对照组、ox-LDL组、ox-LDL+si-CTSS组、ox-LDL+si-NC组。ox-LDL组加入100 μg/ml ox-LDL孵育24 h，ox-LDL+si-CTSS组先使用转染试剂将CTSS siRNA转染至细胞中48 h再加入100 μg/ml ox-LDL孵育24 h，ox-LDL+si-NC组先使用转染试剂将对照siRNA转染至细胞中48 h再加入100 μg/ml ox-LDL孵育24 h，对照组不进行处理。

1.2.2 细胞增殖检测 使用CCK-8试剂盒检测细胞活力。按照1×104个/ml的密度将HUVECs细胞接种到96孔板中，贴壁后按照上述分组处理细胞，ox-LDL加入24 h后，每孔加入10 μl CCK-8溶液在37 ℃条件下继续培养1 h。然后用酶标仪在450 nm波长处检测各孔的吸光值。

1.2.3 细胞凋亡检测 用流式细胞术检测各组细胞凋亡。具体操作如下：按照1.5×105个/孔的密度将HUVECs细胞接种到6孔板中，转染48 h后使用100 μg/ml ox-LDL继续处理24 h。收集各组细胞，PBS缓冲液清洗3次，用500 μl 结合缓冲液重悬细胞，然后加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI溶液37 ℃避光孵育15 min，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.4 ELISA检测细胞因子表达和Western blot检测 收集各组细胞的上清液用ELISA试剂盒检测细胞因子表达。使用RIPA裂解液从各组HUVECs细胞中提取总蛋白。冰浴15 min，4 ℃、12 000 g离心10 min收集上清液即为所提取总蛋白。按照BCA试剂盒的说明书操作测定蛋白浓度。之后，将等量的蛋白样品煮沸5 min，用SDS-PAGE电泳根据分子量大小将蛋白进行分离。将蛋白转移到PVDF膜上，然后用5%脱脂奶粉在室温条件下封闭2 h以阻止非特异性结合，加入适当稀释倍数的一抗4°C过夜孵育。用TBS缓冲液清洗膜3次，加入二抗室温孵育1 h；
用含有0.1%吐温20的TBS缓冲液清洗膜3次后加入ECL发光液观察蛋白条带。使用Image J软件对条带的光度值进行分析，以GAPDH为内参。1.3 统计学分析 所有实验均重复3次，数据采用±s表示，用SPSS19.0软件进行统计分析。两组间差异的比较用Student"st检验；
多组间差异比较采用单因素方差分析并进行Tukey事后检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2.1 ox-LDL可上调内皮细胞中CTSS表达 使用100 μg/ml ox-LDL处理24 h后，检测对照组和ox-LDL组中CTSS蛋白表达。结果如图1所示：与对照组相比，ox-LDL组中CTSS蛋白表达增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 ox-LDL可上调内皮细胞中CTSS表达Fig.1 ox-LDL upregulated CTSS expression in endothelial cells

2.2 下调CTSS可增加ox-LDL抑制的内皮细胞增殖 HUVECs细胞转染CTSS siRNA或者对照siRNA 72 h后，Western blot检测CTSS的表达情况，发现与ox-LDL组相比，ox-LDL+si-CTSS组中CTSS 蛋白表达降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；
但与ox-LDL相比，ox-LDL+si-NC组中CTSS蛋白表达变化不大，差异无统计学意义（P＞0.05，图2A、B）。CCK-8检测细胞活力，结果显示：与对照组相比，ox-LDL组中细胞活力降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；
与ox-LDL组相比，ox-LDL+si-CTSS组中细胞活力增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；
但是与ox-LDL组相比，ox-LDL+si-NC组中细胞活力变化不大，差异无统计学意义（P＞0.05，图2C）。

图2 下调CTSS可增加ox-LDL抑制的内皮细胞增殖Fig.2 Downregulation of CTSS promoted endothelial cell proliferation suppressed by ox-LDL

2.3 下调CTSS可缓解ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡 流式检测细胞凋亡，结果见图3：与对照组相比，ox-LDL组中细胞凋亡率升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；
与ox-LDL组相比，ox-LDL+si-CTSS组中细胞凋亡率降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；
但是与ox-LDL组相比，ox-LDL+si-NC组中细胞凋亡率变化不大，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图3 下调CTSS可缓解ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡Fig.3 Downregulation of CTSS alleviated ox-LDL-induced apoptosis of endothelial cells

2.4 下调CTSS减少ox-LDL诱导的炎症因子表达 ELISA方法检测各组细胞中炎症因子IL-1β和TNF-α含量，结果见图4：与对照组相比，ox-LDL组中IL-1β和TNF-α含量均增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；
与ox-LDL组相比，ox-LDL+si-CTSS组IL-1β和TNF-α含量均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；
但是与ox-LDL组相比，ox-LDL+si-NC组中两种细胞因子变化不大，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图4 下调CTSS减少ox-LDL诱导的炎症因子IL-1β和TNF-α表达Fig.4 Downregulation of CTSS reduced ox-LDL-induced expression of IL-1β and TNF-α

2.5 下调CTSS抑制ox-LDL诱导的内皮间质转化 显微镜观察各组细胞形态，见图5A：对照组细胞呈现规则的鹅卵石样，ox-LDL组中多数细胞变成纺锤样，ox-LDL+si-CTSS组中细胞多数呈鹅卵石样，ox-LDL+si-NC组中细胞多数呈纺锤样。Western blot检测内皮细胞标志物CD31和VE-cadherin以及间质细胞标志物α-SMA和Vimentin蛋白表达水平，结果见图5B～F：与对照组相比，ox-LDL组中CD31和VE-cadherin的表达降低，α-SMA和Vimentin表达升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；
与ox-LDL组相比，ox-LDL+si-CTSS组CD31和VE-cadherin的表达增加，α-SMA和Vimentin表达降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；
但是与ox-LDL组相比，ox-LDL+si-NC组中上述4种蛋白表达变化均不大，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图5 下调CTSS抑制ox-LDL诱导的内皮间质转化Fig.5 Downregulation of CTSS reduced ox-LDL-EndMT in endothelial cells

2.6 下调CTSS通过抑制p38 MAPK通路发挥作用 Western blot检测各组p38表达情况，结果见图6A、B：与对照组相比，ox-LDL组中p-p38/t-p38水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；
与ox-LDL组相比，ox-LDL+si-CTSS组中p-p38/t-p38水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；
但是与ox-LDL组相比，ox-LDL+si-NC组中此比值变化不大，差异无统计学意义（P＞0.05）。此外，在加入ox-LDL前在细胞中加入1 μmol/L p38 MAPK激活剂AM处理1 h，结果发现，与ox-LDL+si-CTSS组相比，ox-LDL+si-CTSS+AM组中细胞活力减弱，TNF-α含量增多，CD31的表达降低，α-SMA表达升高，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；
但是ox-LDL+si-CTSS+AM组中细胞活力和CD31表达仍高于ox-LDL组，TNF-α含量和α-SMA表达仍低于ox-LDL组（图6C～G）。

图6 下调CTSS通过抑制p38 MAPK通路发挥作用Fig.6 Downregulation of CTSS functioned via inhibiting activation of p38 MAPK pathway

2.7 下调CTSS对Akt和ERK1/2通路的影响 Western blot检测各组Akt和ERK1/2通路蛋白，结果见图7：与对照组相比，ox-LDL组中p-Akt/Akt和p-ERK1/2/ERK1/2水平均升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；
与ox-LDL组相比，ox-LDL+si-CTSS组中p-Akt/Akt和p-ERK1/2/ERK1/2水平均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；
但是与ox-LDL组相比，ox-LDL+si-NC组中这两者的比值变化不大，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图7 下调CTSS可抑制ox-LDL诱导的Akt和ERK1/2通路活化Fig.7 Downregulation of CTSS inhibited ox-LDL-induced activation of Akt and ERK1/2 signaling pathways

组织蛋白酶是能够分解与特定氨基酸相连接肽键的溶酶体蛋白酶，它们在蛋白质转换和胞外基质的降解中发挥重要作用。最近的研究发现组织蛋白酶与多种疾病的发生密切相关，如自身免疫性疾病、心脏修复、心肌病和动脉粥样硬化［11］。组织蛋白酶家族由11个成员组成，其中CTSS被认为是一种能有效切割弹性蛋白酶产生有活性的弹性蛋白多肽，引起心血管炎症和钙化的半胱氨酸蛋白酶［11］。研究发现，CTSS在动脉粥样硬化组织和血清中高表达，且参与了动脉粥样硬化的发展过程［8-10］。文献已经证实CTSS可表达于内皮细胞［12］，但是目前CTSS在动脉粥样硬化中内皮细胞损伤中的作用还未见相关报道。因此，本研究从体外实验进一步探究CTSS在动脉粥样硬化内皮细胞损伤中的作用。本研究结果发现CTSS在ox-LDL诱导的内皮细胞中表达上调，这与其在动脉硬化斑块中表达趋势相一致［8］。由此推测CTSS在动脉粥样硬化内皮损伤过程中发挥着重要作用。

Ox-LDL诱导的内皮细胞损伤在动脉粥样硬化中发挥着关键作用，因此本课题进一步探究了CTSS在ox-LDL诱导的内皮细胞损伤中的作用［13］。文献报道ox-LDL可诱导内皮细胞凋亡、炎症和End-MT［14］。在患者的动脉粥样硬化斑块中EndMT的程度与疾病的严重程度密切相关，且EndMT可导致内皮细胞来源的间充质细胞向底层组织的分层和迁移，引起动脉粥样硬化的发生和发展［15］。CD31和VE-cadherin是重要的内皮细胞标志物，而α-SMA和Vimentin是重要的间质细胞标志物。发生EndMT时，内皮细胞的形态发生变化，变成纺锤样，并伴随着CD31和VE-cadherin表达下降，α-SMA和Vimentin表达增加［16-17］。血管内皮细胞炎症会刺激邻近的血管平滑肌细胞表型的改变，进一步导致动脉粥样硬化进展［18］。本研究结果显示ox-LDL可抑制HUVECs细胞增殖，诱导细胞凋亡，增加炎症因子IL-1β和TNF-α含量，诱导细胞EndMT，这表明本课题组成功诱导了内皮细胞损伤模型。在ox-LDL损伤的内皮细胞中通过siRNA技术下调CTSS可促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，减少炎症因子IL-1β和TNF-α含量，抑制EndMT。本研究表明在动脉粥样硬化模型中，抑制CTSS表达可通过抑制内皮细胞凋亡，减少EndMT和炎症反应，减轻内皮细胞损伤，从而抑制中膜增厚，缓解动脉粥样硬化进展。

本课题组进一步探究了CTSS对ox-LDL诱导的内皮细胞损伤的作用机制。促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族是一组丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与细胞生长、增殖、凋亡和功能的调控［19］。MAPK家族主要包括p38 MAPK、JNK、ERK1/2三个主要成员。p38 MAPK可通过多种方式促进动脉粥样硬化的发生［20］。研究发现ox-LDL可通过LOX-1受体诱导内皮细胞中p38 MAPK通路活化。阻断p38 MAPK通路的活化可缓解ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡、炎症和EndMT［19，21-22］。LIN等［8］的研究发现下调CTSS可缓解ox-LDL诱导的骨髓来源的巨噬细胞向泡沫细胞转化、脂质积累和迁移等动脉粥样硬化相关表型，这也与p38 MAPK通路的活化被抑制有关。本研究结果也显示ox-LDL处理可增加HUVECs细胞中p38 MAPK通路的活化，下调CTSS可减少ox-LDL诱导的p38 MAPK的磷酸化，而且p38 MAPK激活剂可逆转CTSS下调对细胞增殖、炎症和EndMT的影响。这表明下调CTSS缓解ox-LDL诱导的内皮细胞损伤是通过抑制p38 MAPK通路发挥作用的。但是p38 MAPK激活剂并没有完全逆转CTSS下调对内皮细胞损伤的作用，这表明可能还有其他通路也参与了CTSS的调节作用。曾有研究表明除了p38 MAPK通路外，CTSS在内皮细胞中还可调节Akt和ERK1/2通路，且ox-LDL可通过Akt和ERK1/2通路诱导内皮细胞损伤［6，23-24］。同样，本研究结果显示ox-LDL可诱导Akt和ERK1/2通路活化；
下调CTSS可抑制ox-LDL活化的Akt和ERK1/2通路。因此，CTSS也可通过Akt和ERK1/2通路调节ox-LDL诱导的内皮细胞损伤。总之，本研究结果显示，CTSS在ox-LDL刺激的HUVECs细胞中表达上调。下调CTSS可通过抑制p38 MAPK通路的活化部分缓解ox-LDL诱导的细胞凋亡、炎症和EndMT。同时，CTSS的作用也与Akt和ERK1/2通路的活化有关。本课题组通过体外实验进一步证实了抑制CTSS表达可通过减轻内皮损伤缓解动脉粥样硬化进展，但是其详细的分子机制有待进一步确证。

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