赵娜娜，杨安沛，加米古丽·木斯尔汗，闫曦蕊

（1.新疆农业大学，乌鲁木齐 830052；
2.新疆农业科学院植物保护研究所/农业部西北荒漠绿洲作物有害生物综合治理重点实验室，乌鲁木齐 830091）

新疆是国内棉花的主产区，总种植面积、单位面积产量和总产量稳居全国首位[1]。棉花在生长发育期内可遭受多种病原菌的侵害，严重影响棉花产量和品质，包括枯萎病、黄萎病、苗期病害（红腐病和立枯病）、以及细菌性角斑病，统称为棉花4大病害[2]。棉花枯萎病是造成棉花产量和纤维品质下降的主要病害之一，在棉花的整个生育期都能造成侵害[3]，是主要由尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum引起的一种真菌土传病害[4]。棉花红腐病病原菌以串珠镰刀菌F.moniliforme为主[5]，近年来发生危害渐增，在适宜条件下造成缺苗断垄、产量和品质大幅下降[6-8]。

甜菜在国内的主产区集中在新疆、内蒙古及黑龙江，总种植面积和总产量约占全国的90%左右。其中，新疆种植面积最大、单产最高[9,10]。在甜菜生育期会发生多种病害，造成甜菜产量损失和质量下降，使得其经济价值大大降低。甜菜根腐病是重要的病害之一，在新疆普遍发生，且有日益加重的趋势，严重者甚至造成绝收，严重制约甜菜生产[11]。甜菜根腐病可由多种病原菌引起，包括黄色镰孢菌F.culmorum引起的镰刀菌根腐病和立枯丝核菌Rhizoctonia solani引起的丝核菌根腐病，据报道，这两种病害在我国所有甜菜产区均有发生，特别是甜菜连年种植的地区[12]。

化学杀菌剂依然是控制棉花和甜菜病害最普遍的策略，如种子包衣、药剂拌种和药剂灌根等[12,13]。然而，化学杀菌剂的频繁使用不仅显著增加了植物病原菌的抗药性，也对环境造成了负担，给非靶标生物造成生命威胁，破坏了生态系统中的自然生物控制能力。因此，植物病原菌的防治亟需开拓其他道路。

植物精油是从植物中提取的芳香类物质，主要成分以萜烯及其氧化物和倍半萜烯为主，此外还有酯、酸、醛、酮等[14,15]，其中醛类、醇和酚类化合物具有抗真菌活性[16]。自然界中植物资源丰富，成分复杂，对植物精油抗菌活性的研究可为新型植物源杀菌剂的化学合成提供依据。本研究通过水蒸汽蒸馏法提取 8种植物精油，以分离自发病棉花的尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌和分离自发病甜菜的黄色镰孢菌、立枯丝核菌为靶标，评价8种植物精油对4种植物病原真菌的抑菌活性，为植物源杀菌剂的开发利用奠定基础。

1.1 材料

1.1.1 植物材料 椒蒿采自新疆伊犁白石峰，驱虫斑鸠菊、啤酒花、一枝蒿和香青兰购于新疆伊鼎辉煌有限公司，蒌蒿、茵陈蒿和黄花蒿分别采集自江苏省、陕西省和河南省。植物标本保存于新疆农业大学农学院天然产物与化学实验室，8种植物信息详见下表1。

表1 供试植物信息Table 1 Directory of tested plants

1.1.2 供试病原菌 尖孢镰刀菌和串珠镰刀菌分离自发病棉花，黄色镰孢菌和立枯丝核菌分离自发病甜菜。4种病原真菌均由新疆农业大学植物病理学实验室提供，菌种现保存于该实验室。

供试培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL。

1.1.3 试验仪器及化学试剂 连续蒸馏装置，北京玻璃仪器厂；
LE204E电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；
PQX-280B-22H人工气候箱，宁波莱福科技有限公司；
电热套，北京市永光明医疗仪器有限公司；
RE-52AA型号旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；
SHB-III循环水式真空泵，郑州长城科工贸有限公司；
数控升降式水浴锅，上海振捷实验设备有限公司。

无水硫酸钠、正己烷（分析纯），天津市致远化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 植物精油的提取 500 g植物（花期）经过自然阴干、剪碎，置于体积为3000 mL的圆底烧瓶中，加入2000 mL水，使用连续蒸馏装置蒸馏6 h；
正己烷萃取油水混合物，无水硫酸钠脱水，旋转蒸发器减压蒸发浓缩（40 ℃）回收正己烷，剩余的油状液体即为精油；
精油收集于棕色瓶中密封保存，测比重，保存于4 ℃冰箱中备用。

1.2.2 菌丝生长抑制法测定植物精油的抑菌活性 含药平板的配制：在无菌操作条件下，将预先融化的49.5 mL的灭菌PDA培养基加入到无菌三角瓶中。正己烷为溶剂，配制浓度为50、5 µL/mL的精油溶液。吸取0.5 mL精油溶液加入到上述三角瓶中混匀，倒入直径90 mm的培养皿，制成相应浓度的含药平板（1 mLPDA中含0.5 µL和0.05 µL精油）。试验设不加精油的处理为空白对照（0.5 mL正己烷）。

接种：选取菌落生长均匀的病原菌，用打孔器在菌落边缘取直径为5 mm菌饼，置于培养基中心，将培养基置于恒温培养箱（25 ℃）中，培养6～9 d。

测量和数据分析：观察对照组培养基的生长情况，待菌丝接近培养皿边缘时，采用十字交叉法测量菌落直径( mm)，重复3 次，取平均值。利用Microsoft Excel 和SPSS 19.00 软件对试验数据进行处理和分析，计算相对抑制率[17]，运用Duncan"s新复极差法进行差异显著性分析。抑制率（%）＝（对照菌落直径－处理菌落直径）/（对照菌落直径－5）×100。根据上述活性测定结果，从中选取抑菌活性较好的精油，正己烷为溶剂稀释成系列浓度（具体浓度如下表2和表3），按上述方法测定精油对4种病原真菌的抑菌活性，制订回归方程y = ax + b，并求其有效中浓度（EC50值）和95%有效浓度（EC95值）。

表2 椒蒿精油的供试浓度Table 2 Test concentrations of the essential oil of A.dracunculus against four fungi

表3 香青兰精油的供试浓度Table 3 Test concentrations of the essential oil of D.moldavica against three fungi

1.2.3 气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）测定精油化学成分 样品送至北京师范大学分析测试中心进行检测鉴定。采用美国Bruker公司450GC-320MS三重四级杆气质联用仪，配备BP-5MS石英毛细管色谱柱（0.25 μm×0.25 mm×30 m)。EI离子源温度：210 ℃；
传输线温度：250 ℃；
进样口温度：250 ℃；
进样量：1 µL，分流比1∶10。升温程序：起始温度50 ℃，停留5 min，之后以10 ℃/min的速率升温至290 ℃，停留15 min。通过HP-MSD化学工作站检索Nist05标准质谱图库，并结合有关文献，检测并鉴定精油化学成分。

2.1 植物精油对4种病原真菌的抑菌活性

2.1.1 植物精油对尖孢镰刀菌的抑菌活性 8种植物精油对尖孢镰刀菌的抑菌活性如表4所示。在精油体积浓度为0.5 µL/mL时，香青兰精油的抑菌率最高，可高达96.11%；
其次为椒蒿和黄花蒿，抑菌率分别为73.20%和69.39%；
其后，依次为一枝蒿、蒌蒿、啤酒花、茵陈蒿，抑菌率分别为57.23%、47.88%、41.82%、31.94%；
活性最弱的是驱虫斑鸠菊，抑菌率仅为12.42%。在精油体积浓度为0.05 µL/mL时，椒蒿、一枝蒿、香青兰、黄花蒿的抑菌活性最强，抑菌率分别为56.21%、49.06%、45.56%和44.90%，四者之间无显著差异；
驱虫斑鸠菊在该浓度下无抑菌活性。

表4 植物精油对尖孢镰刀菌的抑菌活性Table 4 Fungicidal activity of eight essential oils against F.oxysporum

2.1.2 植物精油对串珠镰刀菌的抑菌活性 8种植物精油对串珠镰刀菌的抑菌率如表5所示。在体积浓度为0.5 µL/mL时，椒蒿精油的抑菌活性最强，抑菌率为91.84%，显著优于其他7种植物精油；
其次为黄花蒿和一枝蒿，抑菌率为70.45%和62.60%；
香青兰、蒌蒿、啤酒花和茵陈蒿的活性稍弱，抑菌率分别为46.10%、45.14%、39.72%和39.61%，4种精油对串珠镰刀菌的抑菌活性相当，无显著差异；
驱虫斑鸠菊的活性最弱，抑菌率仅为3.70%。在体积浓度为0.05 µL/mL时，椒蒿精油对串珠镰刀菌依然具有较好的抑菌活性，抑菌率为65.31%，显著优于其他7种植物精油。

表5 植物精油对串珠镰刀菌的抑菌活性Table 5 Fungicidal activity of eight essential oils against F.moniliforme

2.1.3 植物精油对黄色镰孢菌的抑菌活性 8种植物精油对黄色镰孢菌的抑菌活性如表6所示。香青兰精油在体积浓度为0.5 µL/mL时，对黄色镰孢菌的抑菌活性达到100%，可完全抑制该菌丝的生长。其次为椒蒿精油，抑菌率为80.95%。在体积浓度为0.05 µL/mL时，椒蒿精油的抑菌活性与香青兰精油活性相当，无显著差异，抑菌率分别为 61.90%、55.09%。驱虫斑鸠菊精油对黄色镰孢菌无抑菌活性，其他 5种植物精油在两种浓度下，对黄色镰孢菌具有较弱的抑菌活性。

表6 植物精油对黄色镰孢菌的抑菌活性Table 6 Fungicidal activity of eight essential oils against F.culmorum

2.1.4 植物精油对立枯丝核菌的抑菌活性 8种植物精油对立枯丝核菌的抑菌活性如表7所示。在体积浓度为0.5 µL/mL时，香青兰精油抑菌率最高，高达98.55%，次之为椒蒿精油和黄花蒿精油，抑菌率为71.28%和70.91%。在体积浓度为0.05 µL/mL时，椒蒿和黄花蒿精油的抑菌活性依然较好，抑菌率分别为52.73%和61.03%。

表7 植物精油对立枯丝核菌的抑菌活性Table 7 Fungicidal activity of eight essential oils against R.solani

2.2 高活性精油对4种病原真菌的EC50和EC95

2.2.1 椒蒿精油对4种病原菌的EC50和EC95椒蒿精油对4种病原真菌均具有较高的活性。菌丝生长抑制法测定椒蒿精油对4种病原真菌的EC50值和EC95值结果如表8。椒蒿精油对尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、黄色镰孢菌和立枯丝核菌的EC50值分别为0.134、0.083、0.122和0.165 µL/mL，EC95值分别为2.510、0.502、1.739 和 2.015 µL/mL。

表8 椒蒿精油对4种病原真菌的EC50值和EC95值Table 8 EC50 and EC95 value of the essential oil of A.dracunculus against four fungi

2.2.2 香青兰精油对3种病原真菌的EC50生长速率法测定香青兰精油对3种病原真菌的EC50和EC95值结果如表9。香青兰精油对尖孢镰刀菌、黄色镰孢菌和立枯丝核菌的EC50值分别为0.062、0.037和0.194µL/mL，EC95值分别为 0.448、0.173 和 0.455 µL/mL。

表9 香青兰精油对3种病原真菌的EC50值和EC95值Table 9 EC50 and EC95 value of the essential oil of D.moldavica against three fungi

2.3 GC-MS分析椒蒿精油的化学成分

椒蒿精油通过GC-MS检测并鉴定出36个峰，其中出峰时间在21.46 min的物质相对含量最高。由表10的质谱分析结果可知，相对含量最高的为a,a-二甲基-1,4-二氧-2-奈乙醛（72.17%）。

表10 椒蒿精油的化学成分分析（＞1%）Table 10 Chemical constituents of the essential oil derived from A.dracunculus

植物精油来源于自然，在自然界中资源丰富。相比于化学合成杀菌剂，植物精油具有化学成分多样，杀菌谱广，作用靶标位点多样，不易产生抗性，对环境友好，不杀伤非靶标生物等优点。已有研究证明，多种植物精油具有较强的杀菌活性，且杀菌谱广，如大蒜、丁香、石香薷、百里香、牛至精油等[18-20]。据本试验结果可知，椒蒿、黄花蒿、啤酒花、茵陈蒿、香青兰、蒌蒿和一枝蒿7种植物精油对4种病原菌均有一定的抑菌活性，其中香青兰和椒蒿的活性最好。

香青兰系维吾尔族、蒙古族常用药材，在新疆维吾尔自治区、内蒙古自治区具有丰富的植物资源[21]。香青兰精油对尖孢镰刀菌、黄色镰孢菌和立枯丝核菌具有较强的抑菌活性，在体积浓度为0.5 µL/mL时，抑菌率均在 95%以上，对串珠镰刀菌的抑菌活性较弱，抑菌率为 46.10%。据文献报道，香青兰精油的主要成分为乙酸香叶酯（16.26%）、丁香酚（13.90%）、香叶醛（13.20%）、草蒿脑（7.89%）、丙烯酸-2-乙基己酯（8.55%）和橙花醛（7.60%）等[22]。其中，香叶醛、橙花醛具有杀菌活性[23,24]，是该精油主要的关键杀菌物质。椒蒿为菊科蒿属植物，在新疆博尔塔拉蒙古自治州的精河县、温泉县，哈密地区巴里坤哈萨克自治县，伊犁哈萨克自治州察布查尔锡伯自治县等地，都有野生椒蒿的分布；
椒蒿精油对灰葡萄孢菌、油菜菌核病菌、辣椒疫霉病菌和棉花枯萎病菌有较好的抑制活性[25]，结合本试验结果可知椒蒿精油对多种病原真菌具有抑菌活性，椒蒿精油中相对含量最高的为 a,a-二甲基-1,4-二氧-2-奈乙醛(72.17%)，但其是否为关键化学成分还未知，需以活性成分测定为指导对精油进行分离纯化。椒蒿和香青兰均为菊科植物，菊科植物是双子叶植物的一大类，也是种子植物中种类最多的一科，植物源抗菌物质在菊科中广泛存在，开展对菊科植物杀菌活性的研究，对于开发利用丰富的菊科植物资源具有重要意义[26]，本文可为菊科植物绿色抑菌农药的开发提供基础数据。

精油的抗真菌作用是由于其对真菌细胞壁和质膜的影响，这可能与质膜的收缩、菌丝壁变形、细胞质凝聚和菌丝体形成有关[27]；
除此之外，精油成分的疏水性调节阳离子的渗透性，导致质子动力和细胞ATP合成的改变，影响线粒体系统的功能[28]。但确切的抑菌作用机制尚未得到明确的论证。椒蒿和香青兰精油对植物病原真菌的作用机制也暂不明确，值得进一步研究，研究结果可为新型杀菌剂的化学合成提供依据。

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