张 莉，朱雪霞，沈文静，刘 标*

（1.生态环境部南京环境科学研究所/国家环境保护生物多样性与生物安全重点实验室，南京 210042；
2.河海大学海洋学院，南京 210098）

转基因玉米为全球粮食安全做出巨大贡献，截止到2019年，全球转基因玉米种植面积达6090万公顷，占转基因作物总种植面积的31%[1]，全球生产的转基因玉米主要用于饲料、加工和粮食，其中饲用转基因玉米及其副产物的比例可达转基因玉米的 85%[2]。转基因玉米在农业生产中发挥重要作用的同时[3]，其饲喂安全性问题不容忽视。如摄入含有转基因成分的饲料后是否会对动物的生长、繁殖有潜在的不利影响[4]？转基因饲料经动物取食后，在动物胃肠道消化降解过程中是否会产生残留[5]？转基因食品及饲料面临的种种安全性疑虑一定程度上影响了其在农业生产上的应用，且转基因作物作为饲料的历史并不久，饲用转基因饲料是否会对动物乃至人类产生不良影响，仍然是有待于研究的课题。

鱼类作为水生生态系统中最重要的生物组成之一，发挥着重要的生态功能，随着水产养殖的快速发展，转基因作物在鱼饲料加工中的应用越来越广泛，转基因作物对鱼类的潜在饲喂风险的安全评价也愈发重要。目前已有一些研究者开展了转基因作物饲料对鱼类的饲用安全性评价研究，这些研究者主要集中于对大西洋鲑Salmo salar[6-9]、虹鳟Oncorhynchus mykiss[10-12]的研究，相比于大西洋鲑和虹鳟，斑马鱼Danio rerio具有体型小，发育周期短，产卵量大、胚胎透明易于观察等诸多优点[13-15]，作为模式动物在遗传学、发育学、生物医学等多学科领域应用广泛[16-18]。转基因作物应用于饲料领域后，一些研究者开始关注转基因作物饲料对斑马鱼的影响，这些研究所涉及到的转基因作物主要为转基因大豆[19]或者单一性状的转基因玉米[20,21]对斑马鱼生长、食物转化效率和体内酶活性的影响，而对斑马鱼繁殖及外源蛋白体内残留情况的研究还比较少。

玉米作为我国粮饲兼用型作物，一直是国内转基因研发领域的重点。自 2008年转基因重大专项实施后，自主基因、自主技术、自主品种的研发能力显著提升，已研发出一批具有商业化应用前景的转基因玉米品种[22]。2020年1月，农业农村部为2个玉米品种和1个大豆品种颁发了农业转基因生物安全证书（生产应用），进一步加速了转基因玉米产业化进程。DBN9936玉米作为本次获批的玉米品种之一，由大北农生物技术有限公司自主研发，该品种对鳞翅目害虫和草甘膦有较好抗性[23,24]，具有广阔的应用前景，未来DBN9936转基因玉米推广和应用时仍需进行转基因安全监管。另外，DBN9936作为新的转化体具有抗虫和耐除草剂两种抗性，目前同时表达两种外源蛋白的转基因玉米对鱼类的饲喂安全性研究还未见报道。本研究以斑马鱼为研究对象评价DBN9936玉米的饲用安全性，旨在为DBN9936转基因玉米饲用安全性以及预测该转基因玉米商业化种植后对鱼类的影响提供科学数据。

1.1 玉米及饲料配置

供试材料为大北农集团有限公司提供的抗虫和耐除草剂双价转基因玉米 DBN9936（外源基因cry1Ab和epsps）籽粒及其非转基因对照玉米DBN9858籽粒。玉米籽粒在本实验室封闭温室条件下盆栽种植，收获后自然风干使用TC-10型超音速气流粉碎分级机进行低温（＜10 ℃）粉碎至粒径10 μm，以22%剂量添加到斑马鱼饲料中[19]，饲料主要组分和营养成分见表1。制成的斑马鱼饲料为颗粒状，粒径400 μm，制备后的饲料于-20 ℃保存备用。

使用玉米Cry1Ab和EPSPS检测试剂盒（Envirologix）对随机选取的5份DBN9936、DBN9858饲料和商品化饲料进行Cry1Ab和EPSPS蛋白进行测定，结果显示DBN9936两种蛋白的表达量分别为（0.11±0.09）μg/g和（11.47±0.96）μg/g，DBN9858和商品化饲料组检测结果均显示阴性。分别随机抽取3份转基因玉米饲料和亲本玉米饲料进行营养成分测定，经测定两种饲料在蛋白质、脂肪、淀粉等主要营养成分含量一致（表1）。

表1 玉米饲料配方和主要营养成分Table 1 Ingredients and nutritional components of the non-GM maize and GM maize diets

1.2 试验动物和培养方法

受试斑马鱼60日龄，初始平均体长（2.1846±0.348）cm，平均体质量（0.22869±0.052）g（n＝10），试验前来自同一批次的斑马鱼在与试验相同水质和光照的条件下驯养14 d，在驯化期间的死亡率为2%。

试验设置商品化饲料组（商品化饲料为市售寸金热带鱼饲料）、DBN9858玉米饲料组和DBN9936玉米组3个处理，每处理3个重复，每重复30条斑马鱼。试验在30 cm×30 cm×25 cm的独立玻璃培养缸中进行，容水10 L，每个培养缸设置独立的过滤系统。试验中每3 d更换1/3体积的培养水，试验在水温（28±0.5）℃，pH（7.8±0.2），光周期14L∶10D的环境下进行56 d。

试验时，每日8：00，13：00和17：00投食3次，投食量为鱼的初始重量的4%，每2周根据体质量变化调整投喂量，每天观察并记录斑马鱼活动性、食性、外观状况和死亡情况。

1.3 体长和体质量

培养14、28、42和56 d时，随机从各处理缸中捞取10条斑马鱼，饥饿自净24 h后，使用90 mg/L MS-222麻醉剂处理试验鱼1.5 min后，测定每条鱼的体长和体质量，测定后立即将试验鱼放入培养水中进行复苏，随后转入相应的培养缸中继续培养。

1.4 繁殖

56 d饲喂结束后，各处理组每缸随机选取6条雄鱼和3条雌鱼，按照雌雄比1∶2比例进行配对，配对在繁殖缸中进行，配对当日傍晚用隔离板将雌、雄鱼分开，次日7：00将隔离板去除，2 h后将亲鱼移至培养缸，并使用前端修剪过的巴氏吸管将鱼卵收集至盛有35 mL培养水的结晶皿中。统计各组亲鱼产卵量、受精卵个数、死亡卵个数，随后将受精卵使用新鲜10% Hank’s清洗干净，置于28.5 ℃恒温培养箱中静水培养，每日观察受精卵孵化情况，每隔一天更换培养皿用水，对72 h内孵出仔鱼数和幼鱼畸形情况进行计数。

1.5 组织样品Cry1Ab蛋白和EPSPS蛋白Western检测

56 d时，将每缸试验鱼全部取出，麻醉后冰上解剖，取试验鱼肌肉、肝脏、肠道组织，使用4 ℃清水将组织清洗干净，液氮研磨后用RIPA裂解液（Sigma）4 ℃振荡裂解30 min，4 ℃ 10000 r/min离心5 min，收集上清液用于蛋白浓度测定和SDS-PAGE凝胶电泳。蛋白质浓度使用BCA试剂盒（Beyotime）测定。

SDS-PAGE凝胶电泳和蛋白免疫印迹参照Zhang等[25]方法。蛋白上清液与6×上样缓冲液混匀后，98℃ 煮10 min，10000 r/min离心10 min，取上清上样至10% SDS-PAGE凝胶电泳中，上样量约50 μg。电泳结束后使用湿法转至硝酸纤维素膜（Bio Rad）上进行免疫印迹分析，具体操作步骤见文献[25]，测定中以α-tubulin为斑马鱼样品内参蛋白，以DBN9936转基因玉米提取的总蛋白为阳性对照，在双色红外激光成像系统（Licor Odyssey）中显示结果。

1.6 数据统计与分析

采用Excel 2010统计分析软件进行数据整理，试验数据以平均值±标准误（x±SD）表示。使用SPSS 19.0软件ANOVA程序进行单因子方差分析，Tukey’s test进行多重比较，以P＜0.05作为统计学上检验的显著性水准。

2.1 体长

不同饲料处理组斑马鱼的体长如图1。在56 d试验期内，两个玉米粉组试验斑马鱼体长增长模式大体一致，至试验结束时转基因玉米组斑马鱼体长与亲本玉米饲料组分别为（38.45±1.73）mm 和（38.57±1.97）mm，二者没有显著性差异，其他测定时间转基因玉米饲料组斑马鱼体长与亲本玉米饲料组也无显著性差异（P＞0.05）。与商品化饲料相比，除第56 d亲本玉米饲料组和转基因玉米组斑马鱼体长显著较低外，其余测定时间内3个处理组斑马鱼体长并没有差别。

图1 不同处理组斑马鱼体长变化Fig.1 Body length of zebrafish fed commercial, non-GM maize, and GM maize diets

2.2 体质量

14～56 d试验期内，商品化饲料组斑马鱼体质量与转基因玉米粉组没有差异，与此不同的是，在试验第42 d和56 d时，亲本玉米组斑马鱼体质量较商品化饲料组斑马鱼低，分别为（0.354±0.027）g和（0.363±0.034）g，并与同一测定时间商品化饲料组斑马鱼体质量有显著性差异。14～28 d内，转基因玉米组和亲本玉米组斑马鱼体质量相当，至42～56 d时，虽然转基因玉米组体质量较亲本玉米组体质量稍高，但二者并没有达到显著性差异水平（P＞ 0.05），不同饲料处理组斑马鱼体质量随时间变化情况见图2。

图2 不同处理组斑马鱼体质量变化Fig.2 Mean body weights of zebrafish fed commercial, non-GM maize, and GM maize diets

2.3 繁殖

不同处理组斑马鱼的繁殖情况见表2。相对于商品化饲料组，2个玉米粉组斑马鱼表现出一些繁殖劣势，主要表现为产卵数和受精卵数下降，这两组参数与商品化饲料组有显著性差异，但在受精卵率、孵化率和仔鱼畸形率参数上，商品化饲料组和两个玉米粉组并没有显著差异。另外，转基因玉米组和亲本玉米组斑马鱼在所有繁殖参数上均没有显著性差异（P＞0.05）。

表2 不同处理组斑马鱼繁殖指标Table 2 Reproduction of zebrafish fed commercial, non-GM maize, and GM maize diets

2.4 样品Cry1Ab蛋白和EPSPS蛋白Western blot检测

如图3A所示，所有样本的内参α-tubulin蛋白在55 kDa左右都显示清晰条带，说明样本蛋白提取质量符合Western Blot分析需求。由不同处理组斑马鱼肌肉、肝脏和肠道组织样品Cry1Ab蛋白（图3B）和EPSPS（图3C）蛋白Western blot检测结果可知，阳性对照转基因玉米样品中可检测到Cry1Ab蛋白和EPSPS蛋白条带，而饲喂商品化饲料（泳道1～3）、非转基因玉米饲料（泳道4～6）和转基因玉米饲料组（泳道7～9）的斑马鱼肌肉、肝脏、肠道样品均未检测到Cry1Ab蛋白和EPSPS蛋白残留。

图3 不同饲料处理组斑马鱼组织样品中Cry1Ab蛋白和EPSPS蛋白检测Fig.3 Western blot analysis of transgenic Cry1Ab and EPSPS proteins in the tissues of zebrafish fed commercial, non-GM maize,and GM maize diets

随着生产加工中越来越广泛地使用转基因作物作为饲料原料，对转基因作物及产品可能存在的安全问题进行动物饲喂试验已是转基因作物环境安全评价的重要内容[26]。鱼类作为人类蛋白质食物主要来源之一，人们不仅关注摄入转基因饲料是否会影响鱼类健康，还关注转基因成分是否会在鱼肉等产品中产生残留，因此以鱼类为研究对象进行转基因作物的饲用安全性评价研究时，不仅应关注饲喂转基因作物饲料一段时间后，鱼类生长和繁殖是否受到影响，还应关注外源转基因成分在体内被消化和累积的情况。

本研究通过56 d饲喂试验表明，与饲喂DBN9858亲本玉米饲料的斑马鱼相比，DBN9936玉米粉组斑马鱼在体长和体质量参数上与亲本玉米饲料组没有显著性差异，说明DBN9936转基因玉米并没有引起斑马鱼生长方面的不良反应。Sanden等[21]研究使用含有 19%转cry1Ab基因玉米的饲料饲喂斑马鱼 283 d，结果表明斑马鱼体质量未受到影响，与本研究结果一致。Sissener等[19]使用转基因玉米MON810饲喂斑马鱼20 d、董姗姗等[20]用转cry1Ab基因玉米BT799饲喂斑马鱼98 d也得到了相似的结论。本研究与上述研究者的结果表明，摄入转基因玉米饲料后斑马鱼生长良好，斑马鱼体长和体质量未受到影响。

试验期内，摄入含有DBN9936转基因玉米饲料的斑马鱼在产卵数和受精率上与DBN9858亲本玉米组斑马鱼没有显著性差异，受精卵静水孵化后，孵化率和仔鱼畸形率也和亲本饲料组相当。和本研究结果相似的是，董姗姗等[20,27]也指出使用转cry1Ab基因玉米BT799和转Cry1Ie基因玉米IE09S034饲喂斑马鱼98 d后，转基因玉米对斑马鱼产卵量和孵化率没有影响；
在Sanden等[21]研究者的长期饲喂研究中，转基因玉米组斑马鱼的产卵量甚至稍高于非转基因对照组，说明转基因玉米饲料没有对斑马鱼繁殖产生不利影响。另外，两个玉米饲料组在受精卵率、孵化率、仔鱼畸形率与商品化饲料组也没有显著性差异，说明本研究自制的玉米饲料能够满足斑马鱼繁殖营养需求。值得指出的是，在使用自制玉米饲料饲喂斑马鱼后，相比于商品化饲料，虽然两个玉米饲料组在受精卵率、孵化率和仔鱼畸形率与商品化饲料组没有显著性差异，但玉米饲料组斑马鱼仍然表现出产卵量下降的繁殖劣势。与商品化膨化饲料不同的是，本研究自制的颗粒型饲料未添加任何非营养性添加剂（如诱食剂、生长促进剂等），玉米粉中的抗营养因子也会使饲料适口性降低[28]，这些因素可能导致玉米饲料组斑马鱼在摄食量、饲料消化率和利用率等方面有所降低，从而影响鱼类性腺发育和繁殖水平[29]。

转基因饲料中的外源成分在动物体内的消解和转移不仅是转基因饲料安全性评价的重要环节，也是人们非常关心的食品安全问题[25]。对斑马鱼肌肉、肝脏和肠道样品进行外源蛋白Western blot检测，没有在相应组织检测到Cry1Ab或EPSPS蛋白，说明斑马鱼在吸收饲料营养成分过程中，肌肉、肝脏和肠道组织中未发生外源蛋白的转移和残留。目前转基因作物对鱼类的饲用安全性研究中，涉及到外源蛋白在组织中残留的研究还很少，仅有一些研究者检测了摄食转基因玉米后鱼类组织器官中外源 DNA残留情况。Sissener等[19]表明饲喂MON810转基因玉米饲料后，斑马鱼肠道中可以检测到外源基因DNA片段，Dong等[30]使用数字PCR方法也可在斑马鱼肌肉等样品检测到外源基因DNA片段，Chainark等[11]在虹鳟鱼中也有相似的结论，与本研究中外源蛋白没有在斑马鱼组织样品中残留结果不同的是，这些针对外源基因残留的研究表明饲料中的外源 DNA片段或能通过组织循环转移至其他组织[31]，上述结果的差异可能与饲料加工技术对外源基因和外源蛋白的影响不同，也可能与蛋白水平和基因水平检测方法灵敏度差异等因素有关。虽然本研究采用的Western blot方法能够灵敏地检测外源蛋白和降解后的外源蛋白残留片段，但不排除斑马鱼组织中存在低于检测极限的痕量外源蛋白的可能，因此，外源蛋白在鱼类组织中的残留情况还需要进一步研究验证。

综上所述，饲喂转基因玉米56 d，斑马鱼生长良好，体长、体质量和繁殖参数与DBN9858亲本对照组未有显著性差异，DBN9936转基因玉米饲料并没有引起斑马鱼在生长和繁殖方面的不良反应，转基因外源蛋白也未在肌肉、肝脏、肠道组织中残留，说明转基因玉米 DBN9936饲料中的外源成分没有增加斑马鱼健康风险。

猜你喜欢商品化斑马鱼亲本小斑马鱼历险记小天使·二年级语数英综合(2021年8期)2021-08-162010—2020年我国育成甘蔗新品种的亲本分析中国糖料(2021年3期)2021-07-13论虚拟角色名称商品化权益的独立性太原城市职业技术学院学报(2020年9期)2020-11-02橡胶树魏克汉种质资源亲子代生长遗传规律分析热带农业科技(2019年1期)2019-01-14几种苹果砧木实生后代与亲本性状的相关性中国果业信息(2019年11期)2019-01-05明清时期陕西果树商品化趋势及殖民采掠初探现代园艺(2018年2期)2018-03-15瓜蒌不同部位对斑马鱼促血管生成及心脏保护作用中成药(2017年6期)2017-06-13日本商品化权的历史演变与理论探析知识产权(2016年5期)2016-12-01油红O染色在斑马鱼体内脂质染色中的应用中国组织化学与细胞化学杂志(2016年4期)2016-02-27油用向日葵亲本繁殖及杂交制种技术新疆农垦科技(2014年10期)2014-02-28