李晓芳，高 慧，朱绍光，周 鸣，刘亚平，叶喜德**

（1.江西中医药大学附属医院 南昌 330006；
2.江西中医药大学药学院 南昌 330004；
3.江西新干县三湖镇中心卫生院 吉安 331303）

陈皮为芸香科植物橘Citrμs reticμlataBlanco及其栽培变种的干燥成熟果皮，药材分为“陈皮”和“广陈皮（新会陈皮）”，而以广陈皮为质佳。广陈皮为芸香科植物橘的栽培变种茶枝柑Citrus reticulata‘Chachi’的干燥成熟果皮，具理气健脾、燥湿化痰功效[1]。历代本草典籍记载其以“陈久者良”，如《药鉴》[2]中提到“陈皮须用隔年陈”，又如《本草汇言》[3]载“又他药贵新，惟橘皮贵陈”。然而对其陈化年限的界定，历代本草说法不一，如1年、2年、3年或数十年等，也有“陈久”、“陈年”、“多年”等[4]。陈皮因陈化年份不同，其成分和药理活性均有一定差别，对目前于陈皮年份的鉴别常通过感官评价法、近红外光谱或测定其成分组成与含量来鉴别[5-7]。现代研究中对于陈皮在存放过程中挥发性成分与黄酮类成分研究较多，认为陈皮在贮藏过程含量均会有所变化，但对于其具体的变化趋势，不同学者研究结果不尽相同，结论不一[8-12]。

指纹图谱是中药质量评价与控制的重要方法之一，可以较为全面地表征中药所含化学成分，而与多元统计分析相结合可用于不同基原、不同产地、不同炮制品以及不同贮藏年限的中药材成分差异评价。目前文献对广陈皮与陈皮的指纹图谱研究虽较多[12-14]，但运用指纹图谱并结合化学模式识别方法对不同贮藏年限广陈皮进行研究未见相关文献报道。且无论从本草典籍还是现有研究方面来看，对于陈皮陈化多久方可药用或贮藏多久为质佳仍未明确。基于此，本研究采用指纹图谱结合多元统计分析，对贮藏年限1-10年的广陈皮展开整体性研究，并以主要差异成分含量作为定量测定指标，探究不同贮藏年限对广陈皮成分的影响。同时，依照成分含量变化差异，研究成分含量随时间变化规律，以期为陈皮药材的质量控制标准提供参考，为揭示陈皮“陈久者良”科学内涵提供数据支撑。

1.1 药材与试剂

对照品橙皮苷、甜橙黄酮、川陈皮素、橘红素、5-去甲川陈皮素均购于四川省维克奇生物科技有限公 司，批 号 分 别 为wkq20030407、wkq21060106、wkq20031701、wkq20041611、wkq21052610，纯度均≥98%。乙腈和磷酸为色谱纯（GRACE公司），实验用水为自制双蒸水。

广陈皮（编号S1-S10）购于广东省江门市新会陈皮村市场股份有限公司，经江西中医药大学胡生福副教授鉴定为经鉴定为芸香科植物橘的栽培变种茶枝柑（Citrus reticulata‘Chachi’）的干燥成熟果皮。10批陈皮药材见表1、图1。

表1 10批广陈皮药材产地与贮藏年限

图1 10批广陈皮药材外观比较

1.2 仪器

Agilent 1100高效液相色谱仪（配备VWD紫外检测器，安捷伦化学色谱工作站，美国安捷伦公司）；
高速中药粉碎机（型号：YF-111B，瑞安市永历制药机械有限公司）；
超声波清洗器（型号KQ-500E，昆山市超声仪器有限公司）；
十万分之一电子天平（型号：AE240，美国Mettler-Toledo 公司）。

2.1 色谱条件

Syncronis C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 µm）；
流动相为乙腈（A）-0.05%磷酸（B）,梯度洗脱（0-28 min，10%-26% A；
28-32 min，26%-30% A；
32-34 min，30%-40% A；
34-55 min，40%-55% A）；
流速1.0 mL·min-1；
柱温30℃；
进样量5 µL；
检测波长330 nm。

2.2 对照品溶液的制备

取各对照品适量，精密称重，加甲醇溶解并定容，过0.22 µm微孔滤膜。再取上述单一对照品适量，甲醇稀释并定容，制得橙皮苷、甜橙黄酮、川陈皮素、橘红素、5-去甲川陈皮素质量浓度分别为1.020 mg·mL-1、0.020 mg·mL-1、0.412 mg·mL-1、0.218 mg·mL-1、0.018 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取广陈皮粉末0.50 g（过3号筛），精密称重，加入甲醇20 mL，超声40 min后放冷称重，甲醇补足，取续滤液过0.45 µm微孔滤膜，得供试品溶液。

2.4 指纹图谱方法学考察

2.4.1 精密度实验

取广陈皮粉末（S1），按“2.3”项方法进行供试品溶液制备，以“2.1”项下色谱条件进行测定，连续6次。以橙皮苷（10号峰）为参照峰，计算得各共有峰相对保留时间与相对峰面积[15]，得相对保留时间RSD小于0.26%，相对峰面积RSD小于2.78%，表明该仪器的精密度良好。具体见表2。

表2 精密度实验中各共有峰相对保留时间（RRT）和相对峰面积（RPA）

2.4.2 重复性实验

取广陈皮粉末（S1），按“2.3”项方法进行供试品溶液制备，平行制备6份，以“2.1”项下色谱条件进行测定。以橙皮苷（10号峰）为参照峰，计算得各共有峰相对保留时间RSD小于0.45%，相对峰面积RSD小于2.77%，表明该方法的重复性较好。具体见表3。

表3 重复性实验中各共有峰相对保留时间（RRT）和相对峰面积（RPA）

2.4.3 稳定性实验

取S1的同一份供试品溶液，分别于 0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h ，以“2.1”项下色谱条件进行测定，以橙皮苷（10号峰）为参照峰，计算得各共有峰相对保留时间RSD小于0.38%，相对峰面积RSD小于2.65%，表明在24 h内供试品溶液具有良好的稳定性。具体见表4。

表4 稳定性实验中各共有峰相对保留时间（RRT）和相对峰面积（RPA）

2.5 HPLC指纹图谱建立及相似度评价

取10批广陈皮粉末，按“2.3”项方法进行供试品溶液的制备，按“2.1”项色谱条件进样测定。将10批陈皮色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，以S1为参照图谱，经多点校正与Mark峰匹配，共确定了19个共有峰，10批广陈皮的指纹图谱见图2。与橙皮苷、甜橙黄酮、川陈皮素等对照品比对，指认出共有峰中的5个色谱峰，如图3，分别为：峰10（橙皮苷）、峰13（甜橙黄酮）、峰15（川陈皮素）、峰18（橘红素）、峰19（5-去甲川陈皮素）。以橙皮苷（峰10）为参照峰，计算10批广陈皮共有峰的相对保留时间、相对峰面积，见表5和表6。结果得10批次样品相对保留时间RSD为0.14%-0.54%，相对峰面积的RSD为8.87%-52.07%。以对照图谱为参照图谱，对10批广陈皮的指纹图谱进行相似度评价，得10批样品的相似度均大于0.990，表现出较强的相似性，具体见表7。分析发现，10批不同贮藏年限广陈皮的图谱相似度较高，但部分色谱峰相对峰面积RSD大，说明部分成分含量仍存在一定差异。

图2 10批广陈皮的HPLC指纹图谱

图3 供试品溶液HPLC图谱（A）与混合对照品溶液HPLC图谱（B）

表5 10批广陈皮共有峰相对保留时间

表6 10批广陈皮共有峰相对峰面积

表7 10批广陈皮指纹图谱相似度评价结果

2.6 多元统计分析

2.6.1 聚类分析（HCA）

系统聚类是聚类分析方法中的较为常见的一种，也称层次聚类。将10批广陈皮19个共有峰的峰面积导入SPSS 21版软件中，采用离差平方和法（Ward法）联结，欧式距离平方和为度量标准，进行系统聚类分析，根据样品相似度对其分类，聚类分析树状图见图4。当距离为10时，10批广陈皮样品可聚为3类：S1、S3聚为一类，S4、S6聚为一类，S2、S5、S7-S10聚为一类。这说明不同贮藏年限对广陈皮成分变化具有一定的影响，其中1年与3年广陈皮成分变化较为接近，4年与6年广陈皮较接近，而2年、5年，7-10年广陈皮较接近。

图4 10批广陈皮聚类分析树状图

2.6.2 主成分分析（PCA）

进一步将10批广陈皮19个共有峰的峰面积导入SMICA 13.0软件中，进行主成分分析，结果见图5。一共得到4个主成分，累计R2X=0.895，代表模型的拟合能力；
Q2=0.363代表了模型的预测能力，结果表明PCA的模型拟合度较好。由图5中可看出，不同贮藏年限广陈皮能有效区分，说明10批广陈皮样品成分存在差异，其中S1、S3号样品与聚集中心偏离程度较大，而S4、S6号样品稍有偏离，这与聚类分析结果一致。

图5 10批广陈皮（S1-S10）的PCA得分图

将峰面积导入至SPSS 21软件中，结果提取了4个特征值大于1的主成分，4个主成分的特征值为9.459、3.590、2.740、1.265，其方差贡献率为49.787%、18.895%、14.422%、6.565%，累积贡献率为89.760%，表明提取出的4个主成分可代表10批广陈皮药材的大部分信息。峰4、峰5、峰11、峰13（甜橙黄酮）、峰14、峰15（川陈皮素）、峰16、峰18（橘红素）、峰19（5-去甲川陈皮素）在主成分1上有较高的载荷，峰2在主成分2上有较高的载荷（载荷绝对值大于0.7），具体见表8。载荷的绝对值越大，对主成分的贡献越大，对样品的区分影响也越大，这表明以上成分是影响不同贮藏年限广陈皮差异的主要成分。

表8 初始因子载荷矩阵

2.7 多成分含量测定

2.7.1 线性关系考察

精密吸取“2.2”项下的5种成分的混标溶液，加甲醇倍比稀释为2、4、8、16、32倍，得6份不同浓度的混标溶液，按“2.1”项色谱条件测定。以浓度为横坐标（X），待测成分的峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归。橙皮苷、甜橙黄酮等5种成分的线性方程、相关系数与线性范围见表9。

表9 5种化学成分的线性方程、相关系数与线性范围

2.7.2 精密度实验

取广陈皮粉末（S1），按“2.3”项方法进行供试品溶液制备，以“2.1”项下色谱条件进行测定，连续6次，计算得橙皮苷、甜橙黄酮、川陈皮素、橘红素及5-去甲川陈皮素的保留时间RSD分别为0.07%、0.02%、0.03%、0.03%、0.06%，峰面积RSD分别为1.50%、1.26%、1.44%、1.22%、1.57%，表明该仪器精密度良好。具体见表10。

表10 5种成分的保留时间与峰面积及RSD

2.7.3 重复性实验

取广陈皮粉末（S1），按“2.3”项方法进行供试品溶液制备，平行制备6份，以“2.1”项下色谱条件进行测定，计算橙皮苷、甜橙黄酮、川陈皮素、橘红素、5-去甲川陈皮素5种成分含量RSD分别为2.13%、1.88%、1.83%、1.79%、2.42%，表明该方法重复性良好。具体见表11。

表11 重复性实验中5种成分含量及RSD

2.7.4 稳定性实验

取S1的同一份供试品溶液，分别于0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h以“2.1”项下色谱条件测定，计算橙皮苷、甜橙黄酮、川陈皮素、橘红素、5-去甲川陈皮素峰面积的RSD分别为2.52%、1.48%、2.51%、2.10%、2.59%，表明24 h内供试品溶液具有良好的稳定性。具体见表12。

表12 稳定性实验中5种成分峰面积及RSD

2.7.5 加样回收率实验

取已知含量的广陈皮（S1）粉末6份，各0.25 g，精密称定，分别按供试品待测指标成分含量100%，精密加入一定量的混标溶液，按“2.1.3”项方法进行供试品溶液制备，按“2.1”项下的色谱条件测定，计算得橙皮苷、甜橙黄酮、川陈皮素、橘红素、5-去甲川陈皮素的加样回收率分别为96.92%、96.18%、98.46%、99.75%、98.19%，RSD分别为2.12%、2.21%、2.95%、3.08%、2.02%。具体见表13。

表13 广陈皮中5种成分的加样回收率

2.7.6 样品含量测定

取10批广陈皮粉末（过3号筛）0.50 g，精密称定，制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算橙皮苷、甜橙黄酮、川陈皮素、橘皮素、5-去甲川陈皮素5种成分的含量，结果见表14，变化趋势结果见图6。结果显示，10批广陈皮中橙皮苷、甜橙黄酮、川陈皮素、橘红素和5-去甲川陈皮素的含量依次为20.940 mg·g-1-34.780 mg·g-1、0.344 mg·g-1-0.517 mg·g-1、4.667 mg·g-1-7.456 mg·g-1、3.592 mg·g-1-5.879 mg·g-1、0.391 mg·g-1-0.710 mg·g-1。这表明不同贮藏年限的广陈皮中橙皮苷、甜橙黄酮以及川陈皮素等多种成分含量存在差异。

图6 10批广陈皮（S1-S10）多成分含量变化趋势

表14 10批广陈皮含量测定结果

3.1 含量测定指标的选择

广陈皮主要成分为黄酮，具抗氧化、抗炎、抗肿瘤与保肝等药理作用。其中橙皮苷、川陈皮素、橘皮素为2020版《中国药典》中广陈皮质量评价指标成分，橙皮苷因具较强的清除氧自由基能力，表现出强抗氧化活性；
川陈皮素能舒张支气管具平喘作用，同时具有神经保护作用；
甜橙黄酮抗血管生成，同时可抑制人AGS胃癌细胞增殖，发挥抗肿瘤作用；
橘皮素具有很好的祛痰、理气作用；
而5-去甲川陈皮素具抗炎作用[15-16]。结合指纹图谱与主成分分析可知，除橙皮苷外的其它4个成分是引起不同贮藏年限广陈皮差异的成分，故本研究选择橙皮苷、甜橙黄酮、川陈皮素、橘红素和5-去甲川陈皮素作为定量分析指标。

3.2 提取条件的优化

比较提取溶剂与提取时间对广陈皮中橙皮苷、甜橙黄酮与川陈皮素等黄酮类成分含量，及对指纹图谱色谱峰数量的影响，对提取溶剂50%甲醇、70%甲醇、纯甲醇与超声提取时间20 min、30 min、40 min进行了考察。结果表明，提取溶剂为纯甲醇时对陈皮成分的提取效率最好，超声提取40 min对各成分的提取效率高于20 min、30 min，最终确定提取溶剂为纯甲醇，超声提取时间为40 min。

3.3 指纹图谱及多元统计分析

中药指纹图谱可获得标示中药材共有峰的色谱图，能较全面反映中药材化学成分信息，具整体性、模糊性等特点。聚类分析与主成分分析是常用的多元统计方法。聚类分析是一种将未知类别的样本，根据相似性大小进行聚类划分的方法；
而主成分分析是一种降维统计方法，依据贡献率大小（〉85%），把多个指标转化为少数几个综合指标来反映原始数据的信息。指纹图谱结合多元统计分析方法，有助于对中药材质量进行综合评价[17]。

本研究建立了贮藏年限1年-10年广陈皮的HPLC特征指纹图谱并进行相似度分析，同时结合聚类分析、主成分分析等多元统计方法，比较了不同贮藏年限广陈皮成分变化差异。指纹图谱相似度结果表明，10批广陈皮具有较好的一致性，总体质量保持稳定，但部分色谱峰相对峰面积RSD大，仍存在一定差异。聚类分析将10批不同贮藏年限广陈皮分为3类，但并未呈现出按贮藏年限聚类趋势，提示贮藏年限只是广陈皮成分与质量变化的影响因素之一。而造成该聚类差异的主要色谱峰有甜橙黄酮、川陈皮素、橘红素与5-去甲川陈皮素，其中部分成分未进行有效指认，故后续可通过LC-MS技术鉴定其余未知成分。

3.4 多成分含量测定

中药在贮藏过程中自身化学成分会发生变化，且随着贮藏时间的变化其成分含量发生相应的变化。如橙皮苷常随贮藏时间延长而增加[18]，但研究也发现橙皮苷成分下降时，橘皮素成分含量却增加[19]。但也有研究发现其黄酮类含量变化较小[20]，或随贮藏年份变出现波动变化[21]，或部分成分含量在3-10年内增加，15-30年下降[22]。而本研究对贮藏年限1年-10年广陈皮中药典指标成分橙皮苷与差异成分甜橙黄酮、川陈皮素、橘皮素、5-去甲川陈皮素共5种成分进行含量测定，结果发现各成分含量随贮藏时间增加呈波动变化，且其变化趋势存在一定相似性，如与1年陈皮比较，2年陈皮的5种成分含量呈升高趋势，3年陈皮则又呈现出降低趋势，而后随时间延长各成分含量呈现出一定的波动增加与下降趋势，这与部分学者的研究结果一致。

综上所述，本实验对不同贮藏年限广陈皮药材进行了指纹图谱和多元统计分析研究，并建立了广陈皮HPLC指纹图谱与橙皮苷、甜橙黄酮、川陈皮素等多成分HPLC含量测定方法。该法操作简便、准确可靠、重复性好，可用于不同贮藏年限广陈皮药材的指纹图谱研究和多成分含量测定。另外，指纹图谱结合多元统计分析，结果表明广陈皮随贮藏时间的延长，其整体质量相对稳定，但具体成分含量存在差异。其中橙皮苷、甜橙黄酮、川陈皮素、橘皮素与5-去甲川陈皮素等5种成分含量呈波动变化，而不是随着贮藏年份增长而增加的。故陈皮在贮藏过程中，上述成分的变化与其“陈久者良”是否存在相关性尚待进一步验证。

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