贠 晗,李嘉欣,罗冬艳,刘晓玲

(烟台大学生命科学学院,山东 烟台 264005)

STS基因,即类固醇硫酸酯酶基因,其产物STS蛋白常存在于内质网腔或高尔基体中,能作用于类固醇硫酸盐等底物,催化底物的硫酸酯键发生断裂,而类固醇硫酸盐是雌激素、雄激素和胆固醇的代谢前体[1],故STS基因可在激素代谢途径中发挥重要作用。研究发现,人体内STS蛋白可以调节多种组织中雌激素和雄激素的活化[2-3]。STS还可以作用于胆固醇硫酸盐,使其脱硫生成胆固醇[4]。

目前,STS基因的克隆、表达和表征研究主要集中在哺乳动物中[5],在非哺乳动物中,仅有基因组学测序后获得的相应STS序列,组织表达特性及功能相关研究尚未可见[6]。本研究对栉孔扇贝STS基因CDS序列特征、组织表达特征、性腺发育周期表达特征进行了检测分析,以期为后续研究该基因在栉孔扇贝性腺发育中的具体作用奠定基础。

1.1 材料

本研究所用栉孔扇贝(Chlamysfarreri)均购自烟台崆峒岛,选取健康扇贝于过滤海水中暂养过夜, 取各发育时期的性腺,一部分通过组织切片对发育时期进行鉴定,即增殖期、生长期、成熟期[7],剩余部分液氮速冻后存于-80 ℃冰箱,用于提取RNA;选取发育同步的雌雄各组织,包括性腺、闭壳肌、肾脏、外套膜、鳃、肝胰腺,液氮速冻后于-80 ℃冰箱,以提取RNA[8]。上述样本取样数各为5个。

1.2 总RNA的提取与cDNA的合成

柱式动物RNAout试剂盒(北京天恩泽基因科技有限公司)提取各组织RNA,提取的RNA经电泳及超微量分光光度计检测,检验合格的RNA反转录成cDNA(反转录试剂盒购自北京宝日医生物技术有限公司),保存于-20 ℃冰箱备用。

1.3 STS基因CDS序列分析

利用本实验室已有栉孔扇贝转录组数据(本实验室未发表数据),进行序列分析与引物设计,利用Clustal X和DNAman软件进行同源序列比对;利用MEGA 7软件,采用邻接法(Neibor-joining, NJ)构建系统进化树。

1.4 STS基因在各组织及性腺发育周期的qRT- PCR

qRT-PCR特异引物为sq1/sq2(表1),内参基因β-actin引物为A1/A2。每个组织设置3个样本重复,每个样本设置2个技术重复,使用ABI7500型荧光定量PCR仪扩增:95 ℃10 min、(95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,72 ℃ 30 s)×40个循环。采用2-ΔΔCT法计算目的基因的相对表达量,以SPSS软件中One-way ANOVA进行显著性分析,最小显著差法(Least Significant Difference,LSD)多重检验法进行统计分析(P<0.05为显著水平)[9]。

表1 引物序列

2.1 栉孔扇贝性腺发育时期的组织鉴定

如图1所示,增殖期的精巢和卵巢中,性腺的滤泡内仅可见1～2层生殖细胞;而生长期的精巢和卵巢中,性腺的滤泡腔内,更多的生殖细胞出现在滤泡壁上;成熟期的精巢和卵巢中,滤泡内充满了大量生殖细胞。

图1 栉孔扇贝性腺发育不同时期的组织学观察

2.2 STS基因CDS序列特征与分析

如图2所示,栉孔扇贝STS基因CDS 长1755 bp,编码584个氨基酸。STS蛋白序列多重序列比对结果(图3)显示,栉孔扇贝STS蛋白具有与其他物种一样的高度保守结构域:A、B和C,还具有硫酸酯酶家族基因特有的保守半胱氨酸[10-11]。

图2 栉孔扇贝STS基因CDS序列及推导的氨基酸序列

2.3 系统进化分析

如图4所示,栉孔扇贝STS蛋白首先与虾夷扇贝的STS聚类,然后再与牡蛎聚类,最后与其他物种的STS蛋白聚类,这一结果与物种分类地位基本一致。

图4 不同物种STS蛋白系统进化分析

2.4 STS基因的qRT-PCR结果

如图5和图6,STS基因在雌雄各组织中均有表达,说明其表达具有组织广泛性;雌性各组织中,卵巢中的表达量显著高于其他组织(P<0.05),而雄性各组织中,表达量无显著差别。如图7所示,性腺周期中,STS基因在增殖期卵巢中的表达量显著高于其他时期的性腺。在卵巢中,该基因在性腺发育早期的增殖期表达量显著高于发育后期,约为生长期的17.3倍,成熟期的22.4倍;而在精巢中,其表达量随性腺发育无显著差异。

不同字母表示组间差异有统计学意义(P<0.05)。

不同字母表示组间差异有统计学意义(P<0.05)。

不同字母表示相同组织不同组间的差异有统计学意义(P<0.05)。

栉孔扇贝STS基因序列的N端含A、B、C三个保守区,其中B结构域包含发挥重要酶功能的进化保守区(ECRs)活性位点,不同物种该基因的B结构域相似度在90%以上,除B保守区外其他保守区也含有发挥水解底物催化功能的氨基酸[12]。序列分析还发现，栉孔扇贝STS具有硫酸酯酶中被2-氨基-3-氧丙酸残基取代的保守半胱氨酸残基,研究表明催化性硫酸酯酶的生成与半胱氨酸残基转化为2-氨基-3-氧丙酸残基之间存在关联,这种转化是产生具有催化活性硫酸酯酶的必要条件[10]。

REED等[1]发现STS广泛表达于人体的多个组织器官,几乎无处不在,具表达广泛性,常见于人类的生殖道靶细胞(子宫内膜、卵巢、前列腺、睾丸、胎盘),乳房、皮肤、大脑骨骼和血液中,主要调节激素的活化。本研究发现STS在栉孔扇贝不同组织中的表达也具广泛性,与高等动物中的研究结果类似。周志楠等[13]检测发现黔北麻羊(Ovislinnaeus)卵巢、垂体、子宫、输卵管、下丘脑五个组织中STS广泛表达,其中,卵巢表达量最高,推测认为该基因与合成性激素的关键酶有关,其在卵巢中的高表达对雌激素分泌具有影响。李嗣杰[14]认为STS蛋白可水解雌激素前体生成有活性的雌激素,PUROHIT等[15]认为STS是雌激素生成的一条途径中的关键酶。

本研究发现STS在栉孔扇贝卵巢中的表达量显著高于其他组织,推测STS基因在栉孔扇贝卵巢中的相对高表达,或许也与其在雌激素生成和活化中发挥的作用相关,这一发现,或为低等生物中STS的相关研究奠定理论基础。

PAATELA等[16]发现,STS在女性青春期前的卵巢中表达量最高,但此时期雌激素水平显著低于青春期,这种生理活动上的表达上调,可能是一种组织特异性雌激素激活的调控机制,并为后续青春期雌激素的大量产生做准备。本研究发现,STS在栉孔扇贝卵巢发育周期中增殖期的表达量最高,但此时卵巢中E2的含量也显著低于发育后期[17],这一规律与PAATELA对女性卵巢中STS的研究类似,推测扇贝中该时期STS含量的显著增高也是为后续成熟期雌激素的大量产生做准备。人体E2来源主要有几个途径,胆固醇经线粒体内细胞素侧链裂解酶催化形成孕烯醇酮,孕烯醇酮生成DHEA,DHEA在3β-HSD作用下脱氢生成A2,一部分A2在17β-HSD作用下进一步生成T,另外一部分A2在CYP19作用下生成E1,E1再通过还原性的17β-HSD转化为E2;STS参与的一条途径为DHEAS脱硫生成DHEA,DHEA再经上述途径生成激素,另一条途径为E1S脱硫生成E1,E1在17β-HSD作用下转化为E2[2-3]。STS参与E2生成活化的机制研究目前主要集中在人体中,其他物种中较少,KUROGI等[5]克隆了斑马鱼和人的STS基因,并通过外源表达制备了相应的STS蛋白,进一步比较了所制备的STS蛋白对底物胆固醇硫酸盐、DHEA-S和E1-S的催化效率,发现斑马鱼与人类体外原核表达的STS酶活相当,研究者推测STS的生理功能在斑马鱼和人类之间可能是保守的,也说明其外源表达的STS无需剪切加工即为具有酶活性的蛋白产物。但STS在低等海洋无脊椎动物中的相关研究几乎不可见。本研究推测,或许与在人体中的作用途径类似,STS在扇贝卵巢中也仅通过部分途径参与活化生成E2,发育后期E2的大量生成可能还有其他激素生成途径发挥作用,具体机制需要进一步研究。刘建国研究发现,增殖期卵巢中E2含量最低但此时期T的含量却最高[17]。周英俏研究发现,DHEA在雌性大鼠体内优先向雄激素而不是雌激素转化[18]。结合文献推测认为,栉孔扇贝增殖期卵巢中STS的显著高表达,可能也会发挥如人体中一样的作用,即STS可将DHEA-S脱硫生成DHEA,从而可能和小鼠一样优先向雄激素转化。

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