王欢利，严灵君，黄 犀，王仲伟，汤诗杰

(江苏省中国科学院植物研究所，江苏省植物资源研究与利用重点实验室，江苏 南京 210014)

南京椴(Tiliamiqueliana)为我国特有乔木树种，隶属锦葵科(Malvaceae)椴树属(Tilia)，综合应用前景广泛，既是优良的园林绿化和蜜源植物，亦具有极高的药用价值。南京椴野生种群数量较少，目前仅在江苏、安徽、浙江等地有分布，且种群规模较小[1]。已有前人对江苏宝华山和安徽皇藏峪的南京椴群落结构进行分析，发现该区域内南京椴群体多为极小种群，且处于衰退状态[2-3]，野生资源的保护工作已迫在眉睫。

对物种多样性进行全方位评价和遗传背景调查是保护野外种群的重要环节。近年来，DNA分子标记技术已成为分析物种遗传结构时必不可少的手段，其中，SSR标记因其具有共显性、稳定性良好、多态性高等特点广泛应用于植物遗传多样性和遗传结构分析中。SSR标记，也称为微卫星DNA，是一类由几个核苷酸(一般为1～6个)为重复单位组成的串联重复序列。EST-SSR是存在于表达基因序列内的SSR标记[4]，不仅具有SSR标记共显性遗传、稳定性高、分布广等特点[5]，同时具有开发成本较低的特点，而且主要反映了植物功能基因的差异，与表型性状的关系更为密切[6-7]。因此EST-SSR在遗传图谱构建[8-9]、种群遗传多样性[10-13]等领域有着极为重要的意义。

目前在椴树属遗传多样性领域已有一定的研究基础，主要是利用nDNA或cpDNA的PCR-RFLP[14]、RAPD[15-17]等分子标记对银毛椴(T.tomentosa)、毛柱椴(T.dasystyla)、欧洲小叶椴(T.cordata)等进行遗传多样性及遗传结构分析，结果表明椴树属树种都具有较高的遗传多样性，并且不同种群间都具有较高的遗传相似性，但前人的研究均未采用EST-SSR标记。为此，笔者选用15个SSR分子标记对5个南京椴天然群体进行研究，以期揭示南京椴群体遗传多样性及遗传结构的地理分布特点，为南京椴野外群体的保护和利用提供依据。

1.1 试验材料

2018年6—10月，对浙江天台山、江苏牛首山、江苏宝华山和安徽皇藏峪的南京椴天然群体进行野外调查及样品采集，收集5个群体共计93个南京椴单株(表1)。供试植株选取各群体中生长健康、无严重缺陷及病虫害，且树高10 m以上、胸径20 cm以上、间距30 m以上的成年植株，采集各单株新鲜、健康的叶片，分别置于自封袋中加入5倍体积的变色硅胶，干燥保存备用。

表1 5个南京椴群体地理位置及采样信息Table 1 Location and sample size of five populations T. miqueliana

1.2 基因组DNA提取

南京椴基因组DNA的提取采用北京百泰克生物科技有限公司的新型快速植物基因组DNA提取试剂盒(货号：DP3112)。DNA样品经质量分数1%琼脂糖凝胶电泳进行检测后，置于-20 ℃备用。

1.3 PCR扩增及STR分型

采用前期研究中获得的15对稳定性好、多态性丰富的EST-SSR引物，引物序列信息见表2[18]。荧光引物交由上海捷瑞生物工程有限公司合成，标记类型见表2。以基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为20 μL，包含2×TaqMaster Mix 7.5 μL，DNA模板1 μL(5～8 ng)，正向引物和反向引物(10 μmol/L)各0.9 μL，去离子水4.7 μL。PCR反应程序为：预变性95 ℃，3 min；
循环反应95 ℃，15 s；
根据不同引物设置退火温度，15 s；
最后72 ℃，60 s；
共计30个循环。72 ℃延伸5 min，4 ℃储存。PCR产物交由上海捷瑞生物技术有限公司进行毛细管电泳检测，完成STR分型。

表2 15对南京椴EST-SSR引物信息Table 2 Information of EST-SSR primers in T. miqueliana

1.4 数据统计与分析

利用Gene-Marker 2.2.0软件参照Esselink等[19]的方法读取四倍体峰图，对位点的峰面积进行比对读取数据，校验峰图并将数据录入Excel表格中，建立原始数据矩阵。

2.1 南京椴SSR位点扩增多态性

15对SSR引物在93份南京椴样品中，共检测到96个等位基因(124～288 bp)(表3)。15个SSR位点的等位基因(A)的均值为6.4，每个体等位基因(Ai)的均值为2.3。共检测四倍体基因型(G)总数为441，各引物四倍体基因型(G)变化范围为8～65；
四倍体特异基因型(Gi)总数为251，各引物四倍体特异基因型(Gi)变幅为2～50，特异带型比率(R1)范围为15.38%～76.92%。15对引物多态性信息含量(CPIC)均大于0.6，平均值为0.871 0，CPIC值最高的为C3235(0.978 8)，最低的引物为C1050(0.660 2)；
Shannon信息指数(I)平均值为2.728 4，最高的为C3235(3.997 7)，最低的为C1050(1.456 7)，结果与CPIC值一致，表明15对EST-SSR引物多态性高，可以有效揭示南京椴遗传多样性。

表3 SSR引物扩增产物多态性Table 3 Primer amplification product polymorphism

2.2 南京椴群体的遗传多样性

由5个群体的遗传多样性参数(表4)可知，每个位点等位基因数的均值(Al)为5.50±2.43，Al值最高的群体为皇藏峪群体(5.87±2.67)，最低的群体为天台山群体(5.00±2.00)；
每个体在每个位点的平均等位基因数的均值(Aloc)为2.29±0.44，Aloc值最高的群体为宝华山群体，最低的群体为蜀山群体。每个位点四倍体基因型丰富度的均值(Gloc)为9.41±4.29，Gloc值最高的群体为皇藏峪群体(13.20±6.54)，最低的群体为天台山群体(6.73±3.28)。平均观察杂合度(Ho)变化范围为0.59～0.64，其中Ho值最高的群体为宝华山群体；
平均期望杂合度(He)变幅为0.58～0.65，说明各群体均具有较高的杂合性，其中He值最高的群体为宝华山群体。综合Gloc和He值可知：南京椴宝华山群体(P1)和皇藏峪群体(P3)具有较高的遗传多样性。

表4 15对引物在5个南京椴群体的遗传多样性参数Table 4 Genetic diversity parameters of five T. miqueliana populations

2.3 南京椴群体的遗传分化

基因多样性是衡量遗传多样性的指标，基因多样性越高说明群体遗传多样性越高。总体来看，15个位点总基因多样度(Ht)的均值为0.634，群体内基因多样度(Hs)的均值为0.616，但群体间基因多样度(Dst)的均值仅为0.018，表明南京椴遗传变异主要来自群体内。15对引物中，总基因多样性(Ht)最高的引物为B485(0.841)，最低引物B2410(0.425)；
群体内基因多样度(Hs)最高的是B485(0.811)，C1050引物最低。遗传分化系数(Gst)是衡量同一物种种群间基因分化程度的指数，数值越高，基因分化程度越大。15对遗传分化系数(Gst)均值为0.030，进一步说明了南京椴群体间遗传分化较小。比较15对引物的遗传分化系数可知，C1050引物的Gst值最高，为0.110；
C2700和B90的Gst值最低，只有0.002(表5)。

表5 5个南京椴种群的遗传分化Table 5 Genetic differentiation of five T. miqueliana populations

AMOVA分子变异分析结果(表6)表明，群体内变异(为12.847)远大于群体间的方差平方和(0.557)；
同时，群体内变异占总变异的96%，远高于与群体间变异(4%)。群体间遗传分化系数(PhiPT)为0.042，群体间的基因流(Nm)为2.882。以上结果进一步验证了南京椴群体的遗传变异主要来自群体内，群体间遗传分化较小，存在广泛的历史基因流。

表6 5个南京椴群体的AMOVA分析Table 6 Analysis of molecular variance of five T. miqueliana populations

2.4 南京椴群体遗传结构

采用非加权组平均法(UPGMA，unweightedpairgroupmethodarithmeticmeans)，基于Nei’s遗传距离，分别构建南京椴5个天然群体及93个体的聚类树。群体聚类结果(图1)显示：5个群体分为2支，分别为A组和B组，A组为宝华山、牛首山、皇藏峪和蜀山群体；
B组天台山群体单独为1支；
A组进一步被分为2支，其中宝华山和牛首山群体为A1组，皇藏峪和蜀山群体P4为A2组。个体聚类结果(图2)与主坐标分析结果(图3)均表明，5个群体中南京椴个体之间谱系较为混乱，未形成明显的分离群体，可能是由于群体之间存在着较为频繁的基因交流。对群体间地理距离与遗传距离进行Mantel检验，结果显示相关系数R=0.049(P=0.498)，表明南京椴遗传距离与地理距离无显著相关性。结果与主坐标(PCoA)分析一致，5个群体之间存在大量的重叠，说明群体间的个体之间存在大量的基因交流，尚未形成离群的群体。

图1 5个南京椴群体遗传距离聚类Fig.1 The genetic distance clustering of five populations T. miqueliana

图2 南京椴93个体SSR聚类图Fig.2 Phylogenetic tree of the 93 T. miqueliana individuals based on SSR

图3 南京椴93个体SSR主坐标分析图Fig.3 Principal coodinate analysis of SSR in 93 individuals of T. miqueliana

利用Structure2.3.1软件，基于贝叶斯数学模型分析南京椴93个体构成的群体结构。通过StructureHarvester在线软件计算，当Delta值最大时，对应的K值为最优分组数为2组(图4)。当K=2时，5个群体被分为红绿两组(图4)。P1、P2和P5绿色所占比例较高，P3和P4红色比例较高，与聚类分析基本一致。

图4 南京椴5个群体的遗传结构Fig.4 Genetic structure of five T. miqueliana populations

SSR引物的欠缺制约了椴树属植物群体分子层面的研究。本研究使用的SSR引物均表现出良好的多态性，多态性信息含量(CPIC)均大于0.5，根据Botstein等[27]对多态性的定义，15对引物均属于高多态性引物；
15对SSR引物的平均特异基因型比率(R1)达到了45.73%，其中B485、C3235、B2405、B2410引物的特异带型组合较多，平均特异基因型比率都超过了60%，可为南京椴种质鉴定、品种选育及指纹图谱构建等方面提供该技术支撑。

一般认为，群体遗传分化系数(Gst)在0～0.05时，群体存在较小的遗传分化；
Gst在0.05～0.15时，群体具有中等程度的遗传分化[28]。南京椴群体遗传分化系数为0.03，群体间的遗传分化较低。同时93个体聚类及PCoA结果进一步验证了南京椴野外群体间并未形成明显的分化，表明群体间必然存在连续的基因流，这可能是由于长距离的花粉传播，或作为佛教“菩提树”，人类活动促使不同地区南京椴群体的交流。比较15对引物的遗传分化系数(Gst)，仅有3对引物Gst大于0.05，说明所检测的大部分位点分化程度都较低，这与Hao等[29]、范英明等[22]报道的北沙柳和华北落叶松群体分化结果一致，即群体存在较小的遗传分化，进一步证实遗传分化程度低是南京椴群体的内在特征，而非引物选择导致的。同时，AMOVA分析结果表明，南京椴的群体内变异(96%)远大于群体间变异(4%)，结合群体遗传分化分析结果，证明南京椴群体内遗传多样性远大于群体间，这与Hamrick等[30]总结的木本植物遗传结构特征一致，主要原因为南京椴等木本植物寿命长、抗逆性强、异交授粉结实，同时人类活动在一定程度上影响了其群体间的遗传分化。

比较各群体遗传多样性发现：综合基因丰富度(Gloc)与期望杂合度(He)结果表明，安徽蜀山和浙江天台山群体的遗传多样性较低；
而江苏宝华山群体和牛首山群体遗传多样性水平较高。这与汤诗杰等[2-3]基于ISSR和RAPD标记分析的南京椴遗传多样性的研究结果基本一致。群体聚类结果表明，江苏宝华山与江苏牛首山群体聚为一支，安徽皇藏峪与安徽蜀山群体聚为一支，浙江天台山归为单独一支；
Structure群体结构分析则将5个南京椴群体分为两组，其中浙江天台山、江苏宝华山和江苏牛首山群体为同一组，安徽皇藏峪和安徽蜀山群体分为一组，结果与聚类分析基本一致。

本研究在汤诗杰等[2-3]的研究基础上进一步扩大采样范围，补充收集了浙江天台山和安徽蜀山群体内大径级个体，基本覆盖南京椴的主要分布区域江苏、安徽和浙江3省。同时在采样过程中通过对径级的观察，发现南京椴大径级个体主要分布于宝华山和皇藏峪。同时结合汤诗杰等[31-32]对南京椴种群结构的调查，显示宝华山群体和皇藏峪群体中，胸径大于22.5cm的个体数最多。因此，综合遗传多样性，聚类分析及Structure分析结果，推断南京椴引种栽培可能起源于宝华山和皇藏峪。Mental检验否定了南京椴遗传距离与地理距离的相关性，表明南京椴群体的扩张，并非以某个种群为中心向外扩张，更多的是由于人工栽植过程中种子的传播引起。但南京椴群体间遗传化较低，今后的研究过程仍需进一步扩大野外群体采样范围，采用覆盖度更高的标记进一步补充证实南京椴引种栽培中心进而探究南京椴群体起源。

天然群体高水平遗传多样性是生物多样性的基础和核心，是野外群体能够稳定存在并发展的基础，物种群体的稳定性和进化潜力与其遗传多样性有密切的关系[33]。通过对物种遗传多样性及种群间的亲缘关系研究可以提出较为有效的保护措施，例如有研究者对麻花艽(Gentiana straminea)进行遗传多样性分析发现遗传分化系数较低，提出建立保护区的措施保护野外种群[34]。李乃伟等[35]通过对南方红豆杉(Taxus wallichianavar.mairei)的遗传多样性分析，发现南方红豆杉各居群间遗传距离与这些居群的地理生境有关，可以选择环境较好的区域对其进行迁地保护。本研究发现南京椴群体具有较大的遗传进化潜力，因此遗传因素并不是南京椴群体数量减小的主要原因。主要原因可能是南京椴野外繁育瓶颈(异交授粉，结实率低，种子传播受限、萌发困难，幼苗对环境适应性差和生境郁闭度高等因素)及人为干扰。因此，在南京椴野外群体保护过程中，通过设立保护区，防止人为扰动；
同时对遗传多样性较高的宝华山及皇藏峪群体加强保护，采取野外放置蜂箱的方式，促进群体内的异交；
并通过人工辅助育苗技术进行幼苗的繁育，最终在保护区域内选取合适的生境进行移栽，实现种质的回归与更新。

本研究基于EST-SSR标记对江苏宝华山、牛首山，安徽皇藏峪、蜀山和浙江天台山5个南京椴天然群体进行了遗传多样性分析，结果显示南京椴群体均具有丰富的遗传多样性，其中宝华山群体和皇藏峪群体多样性较高，推测这两个群体为南京椴引种起源中心；
然而南京椴群体间未形成明显的分化，未形成离群的群体，表明南京椴群体间可能存在较为广泛的基因交流；
群体的地理距离与遗传距离无相关性，推测南京椴群体扩散的过程中主要是通过人类活动带来的种子基因流。依据上述研究结果，确立了宝华山和牛首山为优先保护群体，提出通过在栖息地建立保护区，加大群体内植株异交，并采用人工繁育及种质回迁的方式保护野外群体。

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