孙 敏，郝 飞，张纹纹，李文良,3,4，杨蕾蕾，毛 立,2，程子龙，刘茂军,3,4

(1.江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室，南京 210014，2.江苏大学生命科学学院，镇江 212013; 3.江苏大学食品与生物工程学院，镇江 212013;4.南京农业大学动物医学院，南京 210095)

宿主先天免疫系统通过模式识别受体(pattern-recognition receptors，PRRs)识别病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)，激活宿主先天免疫应答而进入抗感染状态[1-2]，而干扰素(IFN)介导的先天免疫应答是宿主抵抗病原感染的第一道屏障，具有较强的抗病毒活性[1]。根据干扰素的结构、受体的特异性和来源的细胞种类不同，干扰素被分为I型、II型及III型，其中I型干扰素包括多种类型，包括IFN-α[3-4]。目前人类及不同种属动物中(如猪、鼠、犬、鸡)均报道含有IFN-α编码基因，且均报道存在一定的抗病毒活性[5-8]。人源重组IFN-α可抑制SARS-CoV-2及PEDV复制，且具有剂量依赖性[9-10]，猪源重组IFN-α可抑制VSV及PRV的复制[11]，而目前关于山羊源IFN-α表达特性及抗病毒活性尚不清楚，值得进一步研究。

I型IFN是病毒感染细胞分泌的多肽，其通过激活JAK/STAT信号通路刺激下游干扰素刺激基因(ISGs)的转录表达诱导感染细胞和相邻细胞进入抗病毒状态，由它们调制宿主细胞的各类抗病毒效应[12]。ISG可以正调节或负调节IFN信号，甚至直接阻断病毒复制周期[1, 13]。大多数 ISG分子，比如Mx、Viperin等IFN诱导蛋白可直接作为抗病毒效应分子[14-15]，分别作用于病毒复制周期的不同阶段而发挥抗病毒活性[1, 16]。

目前，养殖方式向集约化、规模化改变，而养殖条件以及防控技术的应用情况却参差不齐，引起呼吸道疫病为主的疫病多发，危害严重。山羊副流感病毒3型(CPIV3)属于副黏病毒科呼吸道病毒属，可引起发病羊表现呼吸道临床症状及相应的病理变化，其可通过气溶胶进行水平传播，具有较强致病性[17-19]。CPIV3在感染过程中可编码非结构蛋白C，死病毒、未感染病毒或早期感染阶段病毒含量较低的细胞裂解物中不含有该蛋白，非结构蛋白C 的表达水平可用于评价CPIV3的增殖效率。目前针对CPIV3感染尚无有效的免疫调控策略，探究山羊IFN-α对该病毒复制的调控作用，并依据非结构蛋白C建立相应的免疫印迹检测方法，为开发有效的预防和治疗措施提供理论支持。

1.1 细胞及病毒培养

MDBK细胞(牛肾细胞)购自美国模式菌种收集中心(ATCC)，由本实验室传代保存。其培养在含10%胎牛血清(FBS，Gibco)的DMEM(北京全式金)营养液中，消化液为0.25%胰酶(含0.02% EDTA, Gibco)。山羊副流感病毒3型(CPIV3)由本实验室保存。MDBK细胞长满单层后PBS洗涤3遍，按照MOI比值为1接种CPIV3 JS2013株第8代(P8，病毒含量为108.0TCID50·0.1 mL-1)，37 ℃孵育1 h后弃除病毒液，向细胞中添加细胞维持液(含有2% FBS的DMEM营养液)，待培养至特定时间收集细胞上清，测定TCID50，计算病毒含量。

1.2 山羊IFN-α原核表达与纯化

根据GenBank中山羊IFN-α编码蛋白的基因序列，去除其信号肽序列后，基因合成相关序列，并获得原核表达重组载体pET-30a-gIFN-α，进而利用热应激方法转化至工程菌Rosetta (DE3)。扩大培养阳性克隆菌液，IPTG(10 μmol·L-1)诱导蛋白表达，细菌破碎、离心，培养上清过His镍柱(GE)和亲和纯化(南京德泰生物科技有限公司)，获得山羊IFN-α。

1.3 SDS-PAGE电泳

将相同浓度的山羊IFN-α和pET-30a表达产物与2×蛋白上样缓冲液(碧云天)1∶1混合后，煮沸10 min使蛋白变性，13 000 r·min-1离心5 min，取上清加入12% SDS变性胶(金斯瑞)，200 V电泳约30 min，取蛋白胶进行考马斯亮蓝染色6 h后进行脱色观察。

1.4 Western blot

原核表达产物进行SDS-PAGE电泳后，取蛋白胶湿转至PVDF膜上(300 mA，1 h)，用含5%脱脂奶的TBST进行封闭(37 ℃，2 h)。封闭后加入His(博士德)单克隆抗体4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，每次10 min，再加HRP标记山羊抗小鼠IgG抗体(博士德)37 ℃孵育1 h，TBST洗涤3次，每次10 min。

同样，将山羊IFN-α(1.0 μg·mL-1)孵育MDBK细胞1 d，同样设立空白细胞对照组和阴性对照组(pET-30a表达产物处理组)，进而按照MOI为1感染CPIV3 JS2013株，于感染后48 h裂解细胞并收集总蛋白。进而将CPIV3感染后的细胞蛋白样品按照上述方法进行SDS-PAGE电泳、转印、封闭，随后加入CPIV3非结构蛋白C特异性单克隆抗体5E4(本实验室自备)或β-actin单克隆抗体(博士德)4 ℃孵育过夜，随后按序进行TBST洗涤、HRP标记山羊抗小鼠IgG抗体孵育、TBST洗涤等。最后，利用ECL 化学发光检测试剂盒(诺唯赞)曝光显色后，全自动化学发光成像分析系统(天能)采集和分析印迹膜图像。

1.5 荧光定量PCR

山羊IFN-α(1.0 μg·mL-1)孵育MDBK细胞1 d后，利用RNAiso Plus(TaKaRa)充分裂解，利用氯仿抽提，异丙醇沉淀的方法提取细胞的总RNA。同时，设置pET-30a表达产物处理组为阴性对照组，脂质体Poly(I:C)(1 μg·mL-1)转染的MDBK细胞为阳性对照组。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)试剂盒(TaKaRa)说明书进行反转录试验。按照SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)试剂盒(TaKaRa)说明书配置反应液，并利用Applied Biosystems Step OneTMReal Time PCR System仪器使用说明书要求进行操作。特定目的基因的反应引物参见表1[20-21]。以细胞β-actin为内参，根据2-△△Ct计算方法测定和比较特定目的基因的相对转录水平。

表1 qPCR反应引物

1.6 山羊IFN-α对CPIV3复制的影响

MDBK细胞于前1 d胰酶消化后铺于12孔细胞培养板，37 ℃，5% CO2培养至长满单层，弃除细胞培养液，PBS洗涤3遍后，利用山羊IFN-α(1.0 μg·mL-1)预处理MDBK细胞1 d，同时设立空白细胞对照组和阴性对照组(pET-30a表达产物处理组)。然后按照MOI为1接种CPIV3，并于接种后不同时间点收集细胞上清，测定病毒滴度；
同时，收集细胞沉淀，利用Western blot检测CPIV3非结构蛋白C和β-actin表达水平。

1.7 数据统计与分析

山羊IFN-α蛋白序列跨膜区预测：http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/。收集不同种属的IFN-α蛋白序列(表2)，利用MegAlign软件对基因序列对齐，利用GraphPad Prism 5软件统计数据的显著性并作图。若P<0.05，则判定为差异显著，并用“*”标识，若P<0.01，则判定为差异极显著，并用“**”标识。

表2 不同种属IFN-α蛋白序列信息

2.1 山羊IFN-α蛋白序列特性分析

山羊IFN-α蛋白全长189aa，NCBI登录号为NP_001272633.1，预期分子质量约19.4 ku。1～18aa为信号肽，同时有一个糖基化位点，位于101aa。TMHMM软件预测其存在一个跨膜区，位于7～29aa(图1A)。序列同源性分析发现，山羊IFN-α与山羊IFN-α-H蛋白同源性最高，同源性为96.3%，其与牛源及绵羊源IFN-α-H蛋白序列同源性分别为92.1%及93.7%，其与人源、猪源及鼠源IFN-α蛋白序列同源性较低，约为55%至70%，而其与犬源IFN-α蛋白序列同源性最低，仅有52.9%(图1B、1C)。

A. 山羊IFN-α蛋白跨膜区分析；
B. 不同种属IFN-α蛋白序列同源性分析；
C. 不同种属IFN-α蛋白序列Clustal V对齐

2.2 山羊IFN-α原核表达、纯化及鉴定

将重组质粒pET-30a(+)-gIFN-α转化至大肠杆菌感受态细胞Rosetta(DE3)，IPTG诱导后收集菌液，超声破碎并离心后收集上清，进行His镍柱和亲和纯化。SDS-PAGE结果显示，在20 ku处有一明显的条带，条带单一，与预期重组蛋白的相对分子质量一致，其浓度为0.20 mg·mL-1(图2A)；
Western blot结果显示，该重组蛋白能与His单克隆抗体发生特异性反应(图2B)，证明重组蛋白被成功表达。

A.山羊IFN-α表达与纯化；
B.Western blot鉴定山羊IFN-α。M.蛋白Marker；
1. pET-30a(+)空载体；
2. pET-30a(+)-gIFN-α纯化产物

2.3 RT-qPCR检测山羊IFN-α作用MDBK细胞后干扰素刺激因子的表达

山羊IFN-α孵育MDBK细胞后，收集细胞的RNA，RT-qPCR检测6种ISGs的转录水平，同时设置阴性对照组(pET-30a表达产物处理组)及阳性对照组(Poly(I:C)处理组)。结果如图3所示，山羊IFN-α孵育细胞后，干扰素刺激因子RSAD2、STAT1、MX1、MX2、ISG15及IFI6的转录水平均显著上调，以RSAD2上调最明显，表明原核表达的山羊IFN-α可以刺激细胞产生干扰素刺激因子(ISGs)。

**. P<0.01，下同

2.4 山羊IFN-α对CPIV3病毒滴度的影响

CPIV3 JS2013株第8代(P8)以MOI比值为1感染MDBK细胞，感染后3 d滴度达到病毒滴度峰值，约108.0TCID50·0.1 mL-1，表明CPIV3 JS2013株在MDBK细胞中可有效增殖(图4A)。山羊IFN-α孵育MDBK细胞1 d后，以MOI比值为1感染CPIV3 JS2013株，收集感染后48及72 h的细胞培养上清。TCID50结果表明，与空白对照相比，pET-30a表达产物不影响CPIV3的复制，而山羊IFN-α处理的细胞对CPIV3复制表现出显著的抑制作用。与阴性对照相比，山羊IFN-α处理组感染后48 h病毒滴度下降98.88%，感染后72 h病毒滴度下降99.47%，表明山羊IFN-α能够在体外显著抑制CPIV3对MDBK细胞的感染能力(图4B)。

A. CPIV3在MDBK细胞中生长曲线；

B. 山羊IFN-α抑制CPIV3在MDBK细胞中增殖

2.5 山羊IFN-α对CPIV3病毒非结构蛋白C表达的影响

山羊IFN-α孵育MDBK细胞1 d后，以MOI比值为1感染CPIV3 JS2013株，收集感染后48 h的细胞沉淀，同时设置空白细胞对照组及阴性对照组(pET-30a表达产物处理组)。Western blot结果表明，与病毒滴度结果相一致，山羊IFN-α显著下调CPIV3非结构蛋白C的表达(图5)。

A. Western blot分析山羊IFN-α对CPIV3非结构蛋白C表达水平；
B. CPIV3非结构蛋白C与内参β-actin间灰度值比

干扰素(IFN)是细胞分泌的一种重要的抗病毒因子[22-23]，目前I型IFN已报道有9个亚型，其中IFN-α 的抗病毒活性最强[24-25]。山羊IFN-α孵育MDBK细胞后，可显著刺激RSAD2、STAT1、MX1、MX2、ISG15及IFI6等6种ISGs的转录上调，其分别编码Viperin、STAT1、MX1、MX2、ISG15及IFI6蛋白。其中STAT1是JAK/STAT通路中关键衔接蛋白，而Viperin、MX1、MX2、ISG15及IFI6已报道可显著抑制CPIV3在MDBK细胞内的复制能力[21, 26]，说明山羊IFN-α通过诱导多种抗病毒蛋白的转录表达而从病毒增殖的不同阶段抑制CPIV3感染过程。

在针对CPIV3对山羊IFN-α抗病毒效应敏感性的研究中，本试验试图寻求一种快速、基于抗体的病毒生长检测方法。副黏病毒的P基因编码形成相应P蛋白及其他多种非结构蛋白[18, 27-28]，其中非结构蛋白是副黏病毒在感染过程中产生的编码产物，其是否表达可有效区别活病毒与死病毒，其表达水平能真实反映病毒在感染细胞内的的复制能力[29]。本研究发现，山羊IFN-α孵育1 d后可显著下调CPIV3非结构蛋白C的表达水平，其结果与病毒滴度变化趋势相一致，进一步证实山羊IFN-α对CPIV3复制具有抑制能力。

干扰素作为一种广谱的抗病毒因子，许多病毒进化出不同策略拮抗JAK/STAT通路抑制下游ISGs的转录激活。已有研究表明，CPIV3感染宿主细胞后再添加山羊IFN-α，其不具有抗病毒效应[20]。而本研究将山羊IFN-α提前孵育细胞后再感染CPIV3，发现其具有显著的抗病毒效应，提示山羊IFN-α对CPIV3感染具有预防效应而不具有治疗效应，指示在防控CPIV3感染过程中山羊IFN-α的给药时机至关重要。

血清学检测发现，CPIV3在山羊及绵羊群体内感染率较高，其中青海及甘肃地区的抗体阳性率高达70%以上，且其可通过气溶胶传播，引起感染动物呼吸道疾病，而目前针对该病原尚无有效的防治策略[19, 30-31]，应给予重视并采取以预防为主的措施。本研究发现，原核表达的山羊IFN-α孵育MDBK细胞后，可显著抑制CPIV3的体外复制，提示其对CPIV3具有较好的预防作用。同时，山羊IFN-α编码基因与牛、绵羊等反刍动物的同源基因间同源性达到90%以上，而山羊IFN-α对其他反刍动物疫病病原在体外复制的影响尚不明确，进一步探索其作为一种广谱的抗病毒分子的潜能具有较大的临床意义。

本研究通过原核表达系统制备的山羊IFN-α，其孵育MDBK细胞可增强ISGs的转录表达，显著抑制CPIV3的复制及非结构蛋白C的表达，为后续CPIV3的防治提供理论基础，并扩展了动物源I型干扰素的基础数据和研究资料。

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