管福来 董业浩 曹井贺 梁鲁南 刘贞辉 孙宝刚**

1.潍坊医学院形态学实验室(山东 潍坊 261053);2.济宁医学院附属医院(山东 济宁 272029)

济宁作为传统的煤矿产区,在不孕不育日常诊疗过程中,从事井下工作的男性不育患者占有一定的比例,作为一种特殊的职业群体,煤矿工人的身心健康引起了社会和企业的关注,并进行了大量的研究工作[1-3]。

但此类工作与男性不育关系的研究较少,并且井下煤矿工作对体外受精-胚胎移植的治疗结局的影响鲜有报道,基于以上研究背景,通过分析井下煤矿工作患者精液质量及其精子功能、辅助生殖妊娠结局以及后代情况,探讨井下煤矿工作对精液质量、精子功能、辅助生殖妊娠结局以及出生后代的影响,为临床上对此类患者进行生育能力评价、治疗措施的选择、妊娠结局的预测、对子代的影响等提供依据。

(一)研究对象

回顾分析济宁医学院附属医院生殖医学中心56例从事井下煤矿工作1 年以上、因妻子输卵管因素行辅助生殖助孕男性患者作为实验组,将103 例正常生育男性、因妻子输卵管因素行辅助生殖助孕者作为对照组。

所有周期均为第一次治疗周期,所有患者进行助孕治疗前均经过详细的一般情况检查、体格检查、内分泌检查、遗传学检查和至少两次精液分析。

对进入研究的对象严格筛选,排除以下因素:①具有严重生殖系统异常的患者;②女方存在其他不孕原因,发现已知的影响辅助生殖助孕妊娠结局的疾病,(其通过子宫输卵管造影或者宫腔镜、腹腔镜手术以及超声检查证实);③男方存在遗传性疾病;④伴有泌尿生殖系统外科疾病;⑤有特殊用药史(如激素类、细胞毒药物);⑥有特殊职业暴露史(如毒物、高强辐射、化工、农药、高温、高湿等);⑦有不良生活史(如吸烟＞10 支/天、酗酒、电脑接触＞8h/天等)。

(二)方法

1.精液常规分析

(1)计算机辅助精子分析(CASA):采用计算机辅助精子分析仪(西班牙,SCA)检测精子密度、总数、各级运动精子百分率和数量等。

(2)精子形态学分析(Diff-Quik 法):精子形态畸形率=畸形精子数/计数精子总数×100%

2.精子功能检查

依照WHO 技术规范采集、处理和检测精液标本,检测实验组与对照组相关精子指标水平。

精子-透明质酸结合率;精子核蛋白不成熟率;精子DNA 碎片率。

(1)精子顶体酶活性检测:使用精子顶体染色试剂盒(PSA-FITC,深圳华康生物)检测精子顶体酶活性,简要步骤如下:测定精液常规参数后,测定和对照Ep 管中加入7.5×106个精子,离心去除精浆,按照试剂盒使用说明操作,依次加入相关试剂,水浴后离心,紫外分光光度计读取各管405nm 的OD 值,计算顶体酶活性。

(2)精子核蛋白组型检测(苯胺蓝染色法,深圳华康生物)利用洗涤液稀释精子浓度至40×106/mL 对于小于该浓度的样本进行离心浓缩)。

取上述调整后的精液1mL 加Eppendorf 管内,1000×g 离心10min,去除精浆。

加1mL 洗涤液,充分混匀。

1000×g 离心3min 去上清液,如此共洗涤3 次。

最后一次离心弃上清液后,加1mL 粘合液。

取5μl 调整后的精液涂片,空气干燥。加固定液固定90s,甩去固定液。

玻片以自来水轻轻冲洗7 次,甩去玻片表面积水,加染液覆盖膜片区,染色5min。

以自来水缓缓冲洗,然后将膜片浸泡至洗脱液中准确脱色18 ～20min,或至膜片无明显蓝色为止。

立即甩去脱色液,以自来水快速洗涤7 次。

迅速吹干或晾干后加封固液1 滴,以盖玻片封片。

油镜计数200 个精子,不成熟核蛋白组型转换异常精子头部呈蓝色,计算头部着色精子百分率。

(3)精子DNA 碎片检测[精子染色质扩散实验(SCD)法,深圳博锐德生物科技有限公司]。

检验方法:①试剂及室温准备:将易熔凝胶管置于80℃孵育20min,待完全融化后,将易熔凝胶管置于37℃待用。检测前将室温调整至20 ～28℃。

②标本制备:将液化的新鲜精子浓度用生理盐水调整至(5 ～10)×106/mL。③检测方法:严格按照试剂盒使用说明给出的检测方法进行检测。

④精子DNA 碎片判定标准:精子头部仅产生较小的光晕或无光晕,单侧光晕的厚度不超过精子头部最小直径的1/3。

SDF(%)= 存在DNA 碎片精子数/被观察精子总数×100%。

(4)精子-透明质酸结合率检测(深圳博锐德生物科技有限公司):将10μl 液化的精液加入透明质酸包被的载玻片(测定孔)“T”孔中后待精液自然扩散到(对照孔)“C”盖上盖玻片孔;室温放置10min 后,在400 倍显微镜下观察精了与玻片上的透明质酸结合情况,计数500 个活动精了,精了-透明质酸结合率(%)=(“T”孔被结合精了数/“T”孔计数活动精了总数-“C”孔被结合精了数/“C”孔计数活动精了总数)×100%。

3.临床操作

(1)控制性超促排卵:实验组与对照组女方均选择长方案超促排卵:于启周期前次月经黄体中期肌注GnRH-α(促性腺激素释放激素激动剂),达菲林1.33mg,月经第3 天开始使用GnRH-α 促排卵,月经第6 天起,行阴道B 超检查卵泡和子宫内膜发育情况,并以此及时调整用药。

直至有2 ～3 个主导卵泡直径在18mm 以上时,结合激素检测结果提示卵泡发育成熟,停用促排卵药物,于当晚8 点注射hCG5000 ～10000u。注射hCG(人绒毛膜促性腺激素)后34 ～36 小时在阴道B 超引导下穿刺取卵,记录取卵数。

4.胚胎实验室操作

(1)精子处理:为了减少或者去除精浆的抗精子抗体,细菌,免疫活性细胞、杂质,达到符合要求的精子浓度,促进精子获能,改善精子受精能力等,将实验组与对照组在授精前须对精子进行必要的处理。

采用密度梯度分离法分离:其具体步骤为:取精子密度梯度分离培养基,吸取1mL 下层(高密度)分离培养基置于离心管中,再吸取1mL 上层分离培养基(低密度)缓慢地注于下层分离培养基的上面。

两层培养基的中间形成一个清晰的界面,37℃培养箱复温。

小心吸取1mL 培养基化的精液覆盖于上层分离培养基的液面。

以(300 ～600)×g 的速度离心20min。

移去所有的分层溶液,只剩底部的沉淀。

加2 ～3mL 洗精培养基,将沉淀混匀。200×g 离心5min。

移去上清,再加入洗精培养基,重复离心洗涤步骤。

用0.5mlIVF 受精培养基沉淀。

进行精子计数和精子质量评估。

将处理获得的精子调整密度(50 ～300)×103/mL 为宜,后置5%CO2、37℃、95%湿度培养箱待用。

(2)受精及胚胎培养:实验组、对照组采用常规的体外受精。

受精后18h 观察原核,出现2 个原核和2 个极体为正常受精卵,未出现2PN 为受精完全失败。

取卵后培养72h 观察胚胎形态,将优质胚胎移植到宫腔内。

胚胎移植后14 天检测尿或血HCG 阳性,移植后4 ～5周超声检查见胎心搏动为临床妊娠。

移植时先选择常规受精来源的胚胎,若无常规受精来源胚胎则移植ICSI 受精胚胎。

(3)胚胎按以下评分标准分级:

胚胎以形态学指标分级:4"-卵裂球大小均匀,碎片为≤5%;3"-卵裂球大小均匀或不等,碎片6% ～20%;2"-卵裂球体积相等或不等,碎片21% ～50%;1"-卵裂球少,碎片＞50%。

1、2 级胚胎在发育过程中出现下列情况,胚胎评级时在形态学基础上降一级:①授精20h 内未见到原核,48h 证实为延迟受精的胚胎。

②取卵后48h超过8 细胞或72h 未超过5 细胞。

正常受精4、3 级胚胎为优质胚胎。

5.计算公式:受精率=正常受精卵数/卵-冠-丘复合体数×100%;优质胚胎率=优质胚胎数/卵裂数×100%;着床率=B 超观察到的妊娠囊数/移植胚胎数×100%;临床妊娠率= 临床妊娠例数/移植周期数×100%;生化妊娠率=生化妊娠周期数/妊娠周期数;流产率=孕28 周前流产周期数/临床妊娠周期数;早产率=发生妊娠≥28 足周至≤37 足周的早产分娩数/产妇总数×100%。

(三)统计学处理

实验数据采用SPSS 16.0 统计软件进行分析。

计量资料用±s表示,比较采用单项方差分析;计数资料用率(比值)表示,比较应用卡方检验。P＜0.05 认为差异有统计学意义,P＜0.01 差异有显著统计学意义。

(一)实验组与正常组一般资料比较(表1)

比较实验组与对照组患者:男、女方年龄、不孕年限、窦卵泡数、女方基础FSH、LH、HCG 日E2、HCG 日子宫内膜厚度差异无统计学意义(P＞0.05),见表1。

表1 实验组与对照组一般资料比较

(二)比较实验组与对照组患者精液质量比较

实验组与对照组相比,精液参数中,精液量、精液浓度无统计学意义(P＞0.05)。

对照组前向运动率、精子活动率、正常形态率组高于实验组,差异有统计学意义(P＜0.05),见表2。

表2 实验组与对照组患者精液质量比较

(三)实验组与对照组患者精液功能比较

对比实验组及对照组精子功能指标发现:实验组顶体酶活性、精子-透明质酸结合率与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05),实验组的DNA 碎片、核蛋白组型高于对照组,差异具有统计学意义(P＜0.05),见表3。

表3 实验组与对照组患者精液功能比较

(四)实验组与对照组辅助生殖结局的比较

对照组的受精率、优质胚胎率高于实验组,差异有统计学意义(P＜0.05),实验组的卵裂率、着床率、生化妊娠率、临床妊娠率与对照组相比差异无统计学意义。(P＞0.05)。

见表4

表4 实验组与对照组辅助生殖结局的比较

(五)实验组与对照组辅助生殖子代的比较

实验组的流产率、出生体重、早产率、双胎妊娠率、男婴比例、出生缺陷率与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。

见表5。

表5 实验组与对照组辅助生殖子代的比较

煤矿工作生产过程中,可能会产生高温、噪音,震动、煤尘和化学毒物等职业危害,同时可能对心理健康产生不利影响,高温会引起睾丸内环境、代谢、免疫反应及生精微循环的改变,从而引发睾丸生精障碍、精液质量下降,最终导致男性不育,使精液质量下降[4-5]。另有研究显示[6-8]:长期暴露在噪音振动职业工作环境下的工人则表现为,精子活力降低,畸形率升高等男性不育的表现。

此外,长期接触煤尘以及微量的有毒有害物质和放射性物质对男性生殖健康都会造成严重的影响[9]。

同时长期高强度的工作加之井下作业的复杂生产环境,其中存在的粉尘、噪声、震动、高温、高湿的生产组织方式和不良体位等职业危害因素也在很大程度上影响着煤矿井下作业人员的身心健康,使他们承受着巨大的心理压力。

长期负性情绪可使机体内分泌和免疫系统发生功能紊乱,可以导致性功能和生殖功能障碍,造成精子质量下降,引发男性不育[10-11]。

本研究结果显示,从事井下煤矿工作的不育患者的精液参数中,精液量、精子浓度与正常生育男性相比无统计学意义。

而从事煤矿的不育患者的前向运动精子率、精子活动率、正常形态率组高于实验组,差异有统计学意义。

从事煤矿的不育患者的顶体酶活性、精子-透明质酸结合率与对照组相比差异无统计学意义,实验组的DNA 碎片、核蛋白组型大于对照组,差异具有统计学意义;这与胡丽丽等的[12]研究相似。

这说明从事煤矿工作的工人长期受到高温、噪音,震动、煤尘和化学毒物等多重不良因素的影响,对其男性生精功能会产生损伤,最终会导致男性不育的发生,具体表现在精子质量的下降,精子功能的损伤等。

作为有可能导致男性不育的煤矿井下工作,目前关于其对体外受精-胚胎移植的治疗结局的影响却鲜有报道。

我们的研究显示:从事井下煤矿工作的不育患者的受精率、优质胚胎率低于对照组,差异有统计学意义。

井下煤矿工作的不育患者的卵裂率、着床率、生化妊娠率、临床妊娠率与对照组相比差异无统计学意义。井下煤矿工作的不育患者的子代影响指标与对照组相比。

实验组的流产率、出生体重、双胎妊娠率、男婴比例、出生缺陷率与对照组相比差异无统计学意义。

而导致井下煤矿工作的不育患者的受精率、优质胚胎率低于正常生育的原因可能是由于精子质量影响辅助生殖结局[13-14],而长期从事煤矿工作会导致患者精子活力下降,精子畸形率升高,可能影响精卵结合及胚胎质量,从而导致受精率和优质胚胎率降低[15]。

我们研究发现井下煤矿工作对男性精液质量、精子功能及辅助生殖结局都有一定的影响。

这需要从事煤矿工作人员应加强自我防范意识,同时煤矿企业也应加强对井下煤矿工人的劳动保护。

但由于本研究样本偏少,结论可能具有一定局限性,还有待于大样本随机对照实验证实。

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