楼金成苗镡允苏嘉琪胡 情翟春涛*吕玉娥

(1.山西中医药大学,山西 晋中 030600;2.山西省针灸医院,太原 030006)

过敏性哮喘(allergic asthma,AS)是一种由2型炎症反应介导的超敏反应所引起的气道慢性损伤性炎症疾病[1]。一系列潜在机制导致气道炎症,导致可变气流受限和呼吸道症状如喘息、气短、胸闷和咳嗽等是过敏性哮喘最典型的特征[2]。在过去几十年中,其流行率大幅上升,全世界有大约3.5亿人受其影响,尤其是在儿童中,患病率显著增加[3]。目前尚无完全治愈方法,但可以通过医生和患者教育、避免环境过敏原暴露、规范化药物治疗和变应原特异性免疫治疗(allergen specific immunotherapy,AIT)等方式来帮助控制症状[4]。

目前过敏性哮喘动物模型的实验动物种属的选择主要集中在豚鼠、小鼠和大鼠三大类[5]。其中豚鼠作为最经典的过敏性哮喘动物选择,可以诱导与人类最相似的炎症反应和气道高反应性。但通常诱导的过敏性哮喘豚鼠模型是由IgG介导的是Ⅰ型变态反应,同时个体反应差异较大,同一批豚鼠同一致敏浓度会出现不致敏或过度致敏导致死亡共存的现象[6]。此外,较少的相关生物学抗体和昂贵的价格使豚鼠不再是构建过敏性哮喘的理想动物模型。大鼠和小鼠的过敏性哮喘动物模型同样具有许多人类过敏性哮喘的特征。然而,过敏性哮喘的主要症状,如气道高反应性和炎症,在大鼠中比在小鼠中更容易再现[7]。此外,与小鼠相比,大鼠体型更大更加容易处理,且能收集到更多的样本。因此,过敏性哮喘大鼠模型的重要性日益增加[8]。本文就近5年国内外通过大鼠构建过敏性哮喘模型的文献进行汇总,从大鼠的品系、造模方法、模型评价等方面对过敏性哮喘大鼠模型的构建进行比较分析。

以(“过敏性哮喘”或“变应性哮喘”)和“大鼠”为主题,时间设定为2017年1月～2022年4月在中国知网(CNKI)、万方医学网、维普期刊全文数据库,并在PubMed数据库(2017～2022)上以“Allergic Asthma”和“Rat”为关键词进行检索,其中CNKI数据库检索到文献105篇,万方数据库38篇,维普数据库17篇,PubMed数据库159篇,选择通过过敏性哮喘大鼠模型进行研究的实验文献、硕博论文,排除综述、科技成果、会议类文献和重复类文献,共有18篇文献符合要求。以下就文献从大鼠的品系、造模方法、模型评价指标等方面进行整理,详细见表1。

表1 过敏性哮喘大鼠模型构建方法Table 1 Construction method of allergic asthma rat model

续表1

续表1

雄性SD大鼠和雄性Wistar大鼠是过敏性哮喘大鼠模型中最常用的品系,两种大鼠致敏后产生的迟发性过敏反应的时间与临床患者时间接近[27]。其中雄性SD大鼠应用较多,可能与其可长时间耐受高浓度激发,从而出现典型的过敏性炎症反应有关[28]。其中,也有文献[26]提到的用雌性BN大鼠造模,并提出与前两种大鼠相比,过敏原致敏后的BN大鼠能更加容易的产生IgE反应,是研究过敏性哮喘最合适的大鼠品系,在国际上使用率越来越高。但较低的繁殖率和高昂的价格,在国内的使用率较少(表2)。

表2 过敏性哮喘模型所用大鼠品系的频数及占比Table 2 Frequency and proportion of rat strains used in allergic asthma models

过敏性哮喘是一种环境与机体相互影响的疾病,其发病机制主要分为致敏即免疫记忆阶段和效应阶段两方面[4]。免疫记忆阶段:当过敏原首次进入气道时,会被抗原提成细胞(如树突状细胞)识别并把他们加工成小肽后与细胞膜表面的主要组织相容性复合体(MHC)II类分子结合形成复合物,并通淋巴管向幼稚的CD4+Th细胞提供过敏原成分,在存在2型细胞因子的情况下,产生过敏原特异性Th2。由Th2细胞产生的IL-4可以促进B细胞成熟并分化为浆细胞,生成抗原sIgE,sIgE与肥大细胞表面的高亲和力IgE受体FcεRI结合,生成IgE抗体,使机体致敏,其中部分增殖的效应Th2成为过敏原特异性记忆T淋巴细胞[4]。效应阶段:当过敏原再次进入机体时,被血液内的IgE识别并结合,促使肥大细胞(Mast Cell,MC)脱颗粒,释放炎性介质产生早期过敏性反应[6,29],表现为血管扩张和支气管收缩等,导致支气管结构功能改变,形成急性哮喘症状[30]。气道慢性炎症反应是效应阶段的延续,Th2细胞向气道炎症部位迁移,在炎症部位受到过敏原攻击时,气道局部释放的趋化因子使Th2细胞释放2型细胞因子如IL-4、IL-5、IL-13等。IL-5对促进组织嗜酸性粒细胞增多和肥大细胞增生至关重要,而IL-13可以刺激杯状细胞产生粘液并诱发气道高反应(Airway Hyper Reactivity,AHR)[31]。故在过敏性哮喘动物模型的造模时,主要也分为两个阶段,分别是致敏期和激发期。

3.1 致敏期

卵清蛋白(OVA)是使用最多的致敏原[32],主要分为单纯OVA和复合OVA(含佐剂,主要包括Al(OH)3等)两大类,具有较强的抗原性和免疫原性。

3.1.1 致敏浓度

分析前文筛选的文献发现,所选文献中共出现了7种不同的OVA致敏浓度。在7种致敏浓度中,最常用的是将1mg OVA溶于含有一定量佐剂(Al(OH)3)中(7篇,38.9%)。致敏浓度及频数见表3。随后将所有文献中所提的OVA的产品目录号及所对应纯度进行检索并整理,发现在一定程度上,致敏浓度的选择与所选OVA的纯度有关,所以过敏性哮喘大鼠模型致敏期间所用的具体造模浓度的选择应根据自身所拥有OVA的纯度来决定。

表3 过敏性哮喘大鼠模型各致敏浓度的频数和占比Table 3 Frequency and proportion of each sensitizing concentration in allergic asthma rat model

3.1.2 致敏方法

致敏操作方法主要分为3种,分别是腹腔注射、皮下注射和皮下注射联合腹腔注射。见表1。同时发现致敏时适当地使用特殊佐剂如脂多糖(LPS)[25]或百日咳毒素[17,26]可以有效的加强致敏效果。

3.2 激发期

最常用来激发哮喘的方式是通过OVA雾化激发,OVA的浓度范围通常在1%～5%之间,雾化次数在7～14次不等。也有文献[26]提示可以通过鼻内滴注的方式来激发哮喘。有研究将相同致敏方式和致敏浓度的大鼠分别用同一浓度的OVA分别雾化激发4周和8周,发现两组大鼠气道损伤情况虽然有些许差异,但差异无统计学意义[33]。

分析前文筛选的文献,总结文献中关于造模后模型的评价指标主要包括:(1)发作时一般行为学观察;(2)肺组织病理形态学观察;(3)肺功能检测;(4)Th2型细胞因子;(5)血清免疫球蛋白IgE;(6)炎性细胞浸润情况(表4)。

表4 过敏性哮喘大鼠模型评价指标Table 4 Evaluation index of allergic asthma rat model

4.1 发作时一般行为学观察

过敏性哮喘大鼠模型哮喘发作期的典型症状表现为造模期间频繁并持续的出现呼吸加快并伴有喘息、口唇黏膜发绀、腹肌痉挛、毛色暗淡并伴有竖起、抓耳挠腮等,并随着激发次数的增多,症状会加重且出现的频率逐渐增加。金禹彤等[14]通过记录各组大鼠引喘潜伏期与发作总持续时间比较;李潘营等[13]通过雾化磷酸组胺和2%的氯化乙酰胆碱等量的混合液后,从第1次喘息开始记录大鼠2 min内的喘息次数来对过敏性哮喘大鼠模型进行评价。

4.2 肺组织病理形态学观察(HE染色)

肺组织的病理形态学观察可以直观的反映在过敏性哮喘发病及持续过程中,肺组织在炎性细胞的浸润下,不断的损伤和修复后产生的病理结构性改变。在过敏性哮喘大鼠模型的肺组织HE染色中,可以看到大鼠支气管周围会出现大量的炎性细胞浸润,部分细支气管上皮坏死,杯状细胞增生、肥大,支气管壁增厚和肺泡严重变形等一系列表现。

4.3 Th2型细胞因子

过敏性哮喘是一种由2型炎症反应介导的慢性肺损伤性炎症,Th2细胞在2型炎症反应的启动、维持和增殖中发挥重要作用。当过敏原暴露并进入呼吸道时,树突状细胞摄取这些过敏原并引导Th2细胞的增殖分化,从而导致Th2型细胞因子如IL-4、IL-5、IL-13等的分泌增加。Th2反应是IgE介导的致敏、气道高反应性 (AHR) 和嗜酸性粒细胞浸润的基础,这些都是过敏性气道疾病的标志。

4.4 血清免疫球蛋白IgE

IgE在过敏性哮喘的发病过程其起着非常重要的作用。Th2细胞通过分泌IL-4和IL-13来激活B细胞的发育并分化成分泌IgE的浆细胞。分泌的IgE与肥大细胞(MC)表面的FcεRI受体结合。再次暴露于该抗原会导致IgE结合的FcεRI受体的交联化,继而导致MC脱颗粒,再次释放先前合成的细胞因子(IL-4和IL-13)导致气道炎症的进行性加重,以及合成新的炎症介质(如组胺、趋化因子和白三烯等)[6,29]。MC释放的炎症介质刺激其他炎症细胞以及结构内皮细胞、上皮细胞和平滑肌细胞,导致支气管痉挛和气道黏液分泌增加,诱发气道高反应(AHR),加重过敏性哮喘的进程[34]。

4.5 嗜酸性粒细胞浸润情况

Th2细胞分泌的IL-5主要负责骨髓和组织中嗜酸粒细胞的生成和激活。在过敏性哮喘患者的支气管肺组织中存在大量炎性细胞浸润[35],嗜酸性粒细胞是其关键的炎症细胞,在过敏性哮喘的气道高反应性、粘液产生和气道重塑中都发挥重要作用。有研究表明通过促进EOS的调亡,可以有效减轻气道炎症,从而达到缓解过敏性哮喘的目的[36]。

4.6 肺功能检测

肺功能检测是诊断哮喘和评估哮喘控制程度的重要检查方法[37]。最常用来进行哮喘模型肺功能检测的方式是肺功能气道反应性测试,用梯度浓度的乙酰胆碱对哮喘模型进行激发并观察呼吸阻力情况。过敏性哮喘模型大鼠检测时可以发现,各梯度乙酰胆碱激发模型组大鼠呼吸阻力较空白组升高明显(P＜0.01)。同时,李潘营等[13]提出,也可以通过氧合指数检测、肺通透指数等方面来对过敏性哮喘大鼠的肺功能进行评价。

随着过敏性哮喘动物模型的出现,大大加快了过敏性哮喘的研究进程,但现有的哮喘模型仅能表现过敏性哮喘某特定阶段的部分病理表现。虽然至今还没有任何一种哮喘动物模型能完全概括人类过敏性哮喘的发生发展过程,但是通过动物实验过程中构建过敏性哮喘动物模型,能使我们更好的研究药物及其他治疗方法对过敏性哮喘机制的影响,为实验结果应用于临床提供可靠帮助。本文对近5年来制作过敏性哮喘大鼠模型时所选用的常用大鼠品系、不同的致敏方式和致敏浓度,以及部分评价造模成功时的指标进行了综合阐述,为后续研究人员在制作过敏性哮喘大鼠模型时,能更准确地选择大鼠品系以及试剂种类,并以此选择合适的造模方式及造模成功的评价方式,提供了有力支持,并推进实验顺利开展。

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