康 舒，厉思雅，杨蓓思，杨晓妍，崔恒林，侯 靖

(江苏大学 食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013)

我国新疆、西藏、内蒙古和青海等地天然盐(碱)湖以及东部沿海地区盐场中嗜盐古菌的多样性得到了系统而深入的研究[4-8]。虽然有研究表明食用盐中含有丰富的嗜盐古菌[9-11]，但是只有少量的研究报道涉及食用盐中嗜盐古菌的多样性[12-13]。

我国是食用盐生产大国，原料来源多样，包括海水、地下盐矿和内陆盐湖。在盐的生产过程中，原料中的大部分嗜盐古菌被捕获在盐晶体中并且能够长期存活。本研究以我国不同产地、不同来源的腌制盐为研究对象，采用高盐培养基进行分离纯化，基于16S rRNA基因序列判断菌株分类学地位，并对不同腌制盐中可培养嗜盐古菌群落结构及多样性进行分析。

1.1 材料与试剂

实验选取五种不同产地的腌制盐，样品基本信息如表1所示。

表1 腌制盐样品基本信息

DNA引物：北京诺赛基因组研究中心有限公司；
PCR扩增试剂盒：生工生物工程(上海)股份有限公司；
DNA marker：宝生物工程(大连)有限公司；
其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

FA2004N电子天平：上海精密科学仪器有限公司；
PHS-3C型精密酸度计：上海理达仪器厂；
高压灭菌器：日本Hirayama公司；
超净台：苏州市金净净化设备科技有限公司；
LRH-250生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；
PCR仪：德国Eppendorf公司；
DYY-6C型电泳仪：北京市六一仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 菌株分离培养

菌株分离采用NHM(neutral haloarchaeal medium)培养基[14]。NHM培养基配方如下：酵母提取物(Oxoid)0.05 g/L，鱼蛋白胨0.25 g/L，丙酮酸钠1.0 g/L，KCl 5.4 g/L，CaCl20.29 g/L，NH4Cl 0.27 g/L，MgSO4·7H2O 26.8 g/L，MgCl2·6H2O 23.0 g/L，NaCl 184.0 g/L，K2HPO40.3 g/L，pH 7.0～7.2。培养基经高压蒸汽灭菌器121 ℃灭菌15 min，固体培养基添加20 g/L琼脂。

无菌条件下称取适量样品，溶解于一定体积的150 g/L NaCl溶液中，使NaCl溶液质量浓度为300 g/L。吸取0.5 mL样品于4.5 mL无菌NaCl溶液中，混匀，此为10-1稀释梯度。重复上述过程2次，得到10-3稀释梯度样品。分别吸取每个稀释梯度样品0.2 mL，均匀涂布于NHM平板，用保鲜膜包好平板，于37 ℃倒置培养一个月。做三组平行实验。待平板上菌落生长后，选择菌落数在25～250的平板进行计数。用无菌牙签挑取单菌落，进行2～3次平板划线分离，获得单菌落纯培养物。

（3）研究结果验证了融资约束的扩大振幅的作用，因此企业的融资约束程度需要控制在合理范围内，不能盲目地缓解企业融资约束。同时，实证结果显示代理成本的作用机制较为突出，企业应该完善内部治理机制，降低双重委托代理问题对海外直接投资经济后果的负向影响 （谢伟峰和陈省宏，2016）［15］。只有在公司治理和内部控制初见成效后解决融资约束问题，才是企业持续健康发展之根本。由于债权融资本质上也是借贷关系，对于降低企业杠杆率没有帮助，在企业杠杆率高企的当下，我国需要大力发展股权融资这一直接融资渠道，发挥股权融资在公司治理机制中的作用。

1.3.2 16S rRNA基因的PCR扩增及测序

采用菌落PCR的方法扩增嗜盐古菌16S rRNA基因。具体方法如下：取少量菌体于50 μL无菌双蒸水中，沸水浴10 min裂解细胞，裂解液作为PCR模板。嗜盐古菌16S rRNA基因PCR扩增的特异性引物为20F(5′-ATTCCGGTTGATCCTGCCGG-3′)和1452R(5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCAG-3′)。采用PCR扩增试剂盒配制PCR反应体系。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；
95 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，反应30个循环；
最后72 ℃延伸10 min。取3 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。阳性PCR产物送北京诺赛基因组研究中心有限公司进行双向测序。

1.3.3 16S rRNA基因序列比对

测得16S rRNA基因序列采用Seqman软件处理后，与Ezbiocloud(http://www.ezbiocloud.net)数据库[15]中16S rRNA基因进行一致性对比，以确定菌株分类学地位。

1.3.4 物种多样性分析

通常认定与已发表菌株16S rDNA相似性小于98.65 %为疑似新种[16]，相似性小于95 %为疑似新属[17]。根据基于16S rRNA基因序列确定的菌株分类地位，计算Shannon多样性指数(H′)、Margalef丰富度指数(DMg)、Shannon均匀度指数(E)和Berger-Parker优势度指数(d)[18]，分析不同腌制盐样品中嗜盐古菌多样性差异。

1.3.5 群落组成差异分析

采用OmicShare Tools的动态PCoA工具分析不同腌制盐样品的群落结构差异，计算Bray-Curtis距离，获得距离关系热图。

2.1 不同腌制盐中可培养嗜盐古菌总数

五种不同产地的腌制盐样品经稀释涂布培养，均获得了较多菌落，表明本实验设计的分离培养方法对腌制盐中嗜盐古菌的分离是有效的。不同腌制盐样品中嗜盐古菌总数如表2所示。中盐样品的嗜盐古菌总数最多，达1.88×106CFU/g，其次是小伙子、茶卡样品，嗜盐古菌总数分别为1.70×104和2.85×103CFU/g。嗜盐古菌总数最少的是雪天和海湾样品，分别为4.11×102和2.21×102CFU/g。雪天和海湾样品均为加碘(KIO3)盐，因此推测KIO3可能对菌落形成有一定影响。

表2 不同腌制盐中嗜盐古菌总数

2.2 不同腌制盐中可培养嗜盐古菌鉴定

经多次划线分离获得单菌落纯培养物，通过16S rDNA测序鉴定其分类学地位。相对丰度大于10%的定义为优势类群。表3和表4总结了不同腌制盐样品可培养嗜盐古菌群落构成及疑似新类群。海湾样品共分离出48株嗜盐古菌，分属于4个属的10个分类单元，另有4株疑似新种，其中Haloarculamarismortui、Natronomonasmoolapensis、Halobacteriumrubrum为优势类群，占比分别为37.5%、16.7%、12.5%。中盐样品共分离出48株嗜盐古菌，分属于5个属的7个分类单元，另有12株疑似新种和12株疑似新属，其中Natronomonasmoolapensis为优势类群，占比为22.9%。小伙子样品共分离出93株嗜盐古菌，分属于12个属的23个分类单元，另有14株疑似新种和5株疑似新属，其中Halolaminasediminis、Halobacteriumrubrum为优势类群，占比分别为21.5%和20.4%。雪天样品共分离出38株嗜盐古菌，分属于2个属的3个分类单元，另有1株疑似新种，其中Halobacteriumrubrum、Halobacteriumnoricense为优势类群，占比分别为60.5%和31.6%。茶卡样品共分离出115株嗜盐古菌，分属于6个属的12个分类单元，另有14株疑似新种和2株疑似新属，其中Halobacteriumnoricense、Halobacteriumrubrum为优势类群，占比分别为34.8%和20.0%。小伙子样品分离得到的类群最多，雪天样品分离得到的类群最少。Halobacteriumrubrum在4种腌制盐样品中均为优势类群。雪天和茶卡样品的优势类群一样，可能是因为两种盐同为湖盐。5种腌制盐样品中均分离得到嗜盐古菌新类群，尤其是中盐、小伙子和茶卡样品，暗示着我国腌制盐样品中存在大量的嗜盐古菌新物种。

表3 不同腌制盐中可培养嗜盐古菌群落构成

表4 不同腌制盐中可培养嗜盐古菌疑似新类群

续表4:

2.3 不同腌制盐中可培养嗜盐古菌多样性分析

腌制盐样品中嗜盐古菌属水平相对丰度如图1所示。海湾样品优势属为Haloarcula、Natronomonas和Halobacterium，中盐样品优势属为Natronomonas和Halorientalis，小伙子样品优势属为Halobacterium和Halolamina，雪天样品优势属为Halobacterium，茶卡样品优势属为Halobacterium和Halolamina。比利时学者对26种食用盐中嗜盐古菌多样性进行研究，得出Haloarcula、Halobacterium和Halorubrum是食用盐中的优势类群。本研究中，Haloarcula为海湾样品中的优势属，Halobacterium在4种样品中均为优势属。Halorubrum在本研究的5种腌制盐样品中均不是优势类群。这些结果表明，不同的食用盐中嗜盐古菌群落组成不尽相同。Haloarcula和Halobacterium属的嗜盐古菌在腌制食品中也广泛存在[19]。随着肠道菌群研究的不断深入，发现Halobacterium和Halorubrum属的嗜盐古菌存在于人体肠道内，可能是通过食用盐或腌制食品摄入，但是嗜盐古菌对人类健康的影响尚未明确。

基于16S rRNA基因序列分析获得菌株分类地位，对不同腌制盐样品物种多样性水平进行计算，结果如表5所示。小伙子样品和中盐样品的Shannon多样性指数和Margalef丰富度指数最高，雪天样品的Shannon多样性指数和Margalef丰富度指数最低，表明小伙子样品和中盐样品具有较高的物种多样性，雪天样品物种分布较单一。雪天样品的Berger-Parker优势度指数最高，表明其优势物种的优势地位最明显，这与优势类群分析结果一致。雪天样品两个优势类群总占比高达92.1%，远高于其他4个样品的优势类群总占比。多样性分析结果表明，由于原料来源及加工方式等不同，不同腌制盐形成了各自独特的嗜盐古菌群落结构。

图1 腌制盐样品中嗜盐古菌属水平相对丰度

表5 不同腌制盐样品中可培养嗜盐古菌多样性指数

2.4 不同腌制盐中可培养嗜盐古菌群落组成差异分析

计算腌制盐样品Bray-Curtis距离，关系热图如图2所示。雪天和茶卡样品群落组成结构最相似，推测因为雪天盐和茶卡盐同为湖盐。茶卡和小伙子样品群落组成较相似，其他样品群落组成结构存在较大差异。雪天和中盐样品群落组成差异最大。

图2 腌制盐样品Bray-Curtis距离关系热图

我国是食用盐生产大国，对腌制盐中嗜盐古菌多样性的研究能够丰富和完善嗜盐古菌物种资源，具有潜在的应用价值。研究表明，不同腌制盐中均蕴藏着丰富的嗜盐古菌资源，尤其是较高比例的新类群，但是群落组成结构不尽相同。小伙子样品和中盐样品具有较高的物种多样性，雪天样品物种分布较单一。群落组成差异分析表明两种湖盐群落组成结构最相似。在后期研究中，将结合高通量测序和培养条件优化，进一步系统深入地探究我国腌制盐中嗜盐古菌的多样性。

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