童 丹

（甘肃中医药大学，兰州 730000）

黄芪是经典的多效中药[1]，药用历史久远，除用于治疗人体疾病之外，还大量用于兽医临床中。如黄芪、淫羊藿、 红花合剂能有效提升公鸡的腔上囊重量，促进腔上囊发育。

黄芪作为抗病毒药物，常用于治疗动物病毒性感冒，可提高动物机体的免疫力。

黄芪作为补气药材，可提高细胞质及血液中皮质酮浓度，减弱动物机体对各种不良应激的敏感性，减少各种应激性综合征发生率，从而有效降低病死率。

黄芪已被列入国家卫健委117 种“药食同源”植物，并作为饲料添加剂被广泛应用。黄芪及黄芪提取物作为新型中草药饲料添加剂，可促进动物生长、增强动物机体免疫力、提高机体抵抗力、降低料肉比、提高动物产品品质和产量。

黄芪甲苷作为黄芪的主要药理活性成分之一，具有调节免疫抗氧化、抗菌消炎、抗应激及促生长等作用[2]，还能提高机体新陈代谢、调节肠道微生态、抗病毒和增强机体免疫力等多种药理活性[3]。

《中国药典》（2015 年版）规定黄芪甲苷含量是黄芪质量控制的主要指标。以黄芪甲苷提取量为衡量指标，采用醇提法，通过四因素三水平正交试验设计，优化黄芪甲苷提取工艺[4][5-7]，确定黄芪甲苷最佳提取工艺参数，为黄芪甲苷提取及开发利用提供理论依据。

1.1 试验材料

黄芪药材产自甘肃中医药大学定西校区药材种植试验园。

1.2 试剂

黄芪甲苷标准品，购自上海源叶生物科技有限公司，批号CJ0101QA14。

其余试剂均为分析纯。

1.3 仪器设备

UV-2600 紫外-可见分光光度计：
日本岛津公司；
Million-QB 超纯水机：Million 公司；
CXP-100 高速多功能粉碎机：
上海市晟喜制药机械有限公司；
SB-5200DT 超声波清洗机：
宁波新芝生物科技股份有限公司；
数HH-4 型显恒温水浴锅：上海高兴仪器设备有限公司；
BT224S 电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）；
DZF-6050-T 智能真空干燥箱：
上海丙林电子科技有限公司；
DZF-6090 真空冷冻干燥器：
上海中友仪器设备有限公司；
TGL-20B-C 离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.4 试验方法

1.4.1 黄芪甲苷供试液制备黄芪洗干净，晒干，切段，粉碎，再用孔径40 目的筛子过筛，通风干燥保存备用。准确称量已处理好的黄芪粉末4.0 g， 用一定浓度的乙醇溶液作为提取溶剂，在数显恒温水浴锅中回流提取，趁热过滤，收集滤液，用旋转蒸发仪将乙醇蒸出，即得糖浆状样品。然后，用甲醇定容至50 mL，得到黄芪甲苷供试液。

1.4.2 甲苷对照品溶液制备准确称取干燥至恒重的黄芪甲苷对照品适量，用80 %甲醇溶解，配制成浓度为0.32 mg/mL 的黄芪甲苷对照品溶液。

1.4.3 黄芪甲苷标准曲线的建立分别准确吸取0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mL 配制好的黄芪甲苷对照品溶液，置于6 只10 mL 具塞比色管中；
向6 只具塞比色管加入0.2 mL5%香草醛-冰醋酸， 再分别加入0.8 mL 高氯酸溶液，轻微振荡混匀，置 70 ℃水浴15 min 后取出，置于冰浴中；
分别向样品中缓慢加入5 mL 纯冰醋酸溶液，取出，摇匀，至室温，再用80%乙醇定容至刻度。

以相应试剂为空白，利用紫外-可见分光光度法测定样品溶液的吸光度值，测定波长为578 nm；
以溶液浓度（c）为横坐标，吸光度值（A）为纵坐标，绘制工作曲线，得到线性回归方程为：

相关系数r=0.999 2， 黄芪甲苷工作曲线的线性范围为1.6～25.6 μg/mL，线性回归方程在线性范围内呈现良好的线性关系。

测定黄芪甲苷提取液含量的方法类同。

1.4.4 黄芪甲苷含量的测定取一定量已制备好的黄芪甲苷供试液，按照“1.4.3”方法测定黄芪甲苷含量。

2.1 仪器精密度试验

精密吸取一定量的黄芪甲苷对照品溶液，测定其黄芪甲苷得率。

测定6 次，计算测定结果相对标准偏差 RSD 值。

经测定，RSD 值为 2.5%，这表明 6 次测定结果的相对标准偏差符合要求，该仪器精密度良好。

2.2 重复性试验

取同批等量的6 份黄芪样品进行黄芪甲苷的提取，测定其黄芪甲苷得率，计算6 次得率的RSD 值。经测定，RSD 值为2.2%，这表明本试验采用的测定方法的重现性良好。

2.3 稳定性试验

精密吸取黄芪甲苷供试品溶液， 分别在制备0，2，4，8，10 h 后进行黄芪甲苷含量测定， 计算其RSD 值。经测定，RSD 值为0.78%，这表明本次测定的结果符合要求，黄芪甲苷溶液在10 h 内稳定性良好。

2.4 加样回收试验

精密称取已知含量的黄芪粉末1.0 g 共18 份，每组 3 份， 分别精密吸取黄芪甲苷对照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL，加入其中，测定其黄芪甲苷得率。

经测定计算， 得到回收率94.7%，RSD 值1.4%。

2.5 正交试验法设计黄芪甲苷提取工艺

采用正交试验法设计黄芪甲苷提取工艺，选取对黄芪甲苷提取效率影响较大的料液比（A）、乙醇浓度（B）、提取温度（C）、提取时间（D）为主要影响因素，以黄芪甲苷提取量为考察指标，采用醇提法提取黄芪甲苷，采用四因素三水平L9（34）正交试验设计见表1，试验结果见表2。

通过对各个参数进行优化，以获得高提取率的关键工艺参数组合。

表1 正交试验因素水平Table 1 Orthogonal test factor levels

表2 正交试验极差分析结果Table 2 Results of orthogonal test range analysis

由表2 正交试验极差分析得知，在选定的试验范围内， 影响黄芪甲苷提取量的因素顺序为：B＞C＞D＞A，即乙醇浓度＞提取温度＞提取时间＞料液比，其影响最显著的是乙醇浓度。综合考虑影响黄芪甲苷提取量的因素水平，选取的最优参数组合为A1B3C3D3，即最佳的提取条件为：乙醇浓度90%，提取温度80 ℃，提取时间120 min，料液比1∶16。按此条件在正交表的9次试验中第3 个试验出现，测定结果得到黄芪甲苷的提取量为96.89 mg/4.0 g。

通过方法学验证及正交试验，对料液比、乙醇浓度、提取温度、提取时间4 个关键提取工艺参数进行优化， 得出黄芪药材中黄芪甲苷的提取工艺参数为：料液比1∶16，乙醇浓度90%，提取温度80 ℃，提取时间120 min，黄芪甲苷提取量为96.89 mg/4.0 g。

该提取工艺方法合理，可为黄芪中黄芪甲苷的提取和工业化生产提供理论参考和技术支持。

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