杨 薇，王宗伟，王子元，刘 洁，张 民，王 静,*

(1.北京工商大学 食品与健康学院， 北京 100048；
2.天津农学院 基础科学学院， 天津 300392；
3.天津农学院 食品科学与生物工程学院， 天津 300392)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)主要表现为认知障碍和记忆功能衰退[1]，在老年人中具有较高发病率，且病因复杂多样，AD的一个重要临床病理特征是β淀粉样蛋白(β-amyloid, Aβ)异常聚集[2]。Aβ的大量聚集和沉积致使细胞膜的完整性和功能性严重受损，进而促使细胞内活性氧自由基(ROS)的大量生成，引起大脑氧化应激反应，诱导细胞凋亡，引发机体认知障碍[3]。Aβ由39～43个氨基酸组成，以含有40个氨基酸的Aβ1-40和含有42个氨基酸的Aβ1-42为主。小胶质细胞 (microglia, MG)是一种存在于中枢神经系统中的主要免疫细胞，即特殊巨噬细胞[4], 游走在脑组织中，吞噬死亡、受伤的细胞以及外来入侵者，对维持大脑功能稳定发挥重要作用[5]。由于AD具有复杂的发病机制，研究表明Aβ沉积、胶质细胞活化增生、氧化应激和炎症等多种因素都参与了AD病情的发生和发展[6-7]，减轻Aβ的沉积、氧化应激和炎症成为目前防控AD的关键手段[8-9]。相较于具有副作用和依赖性的药物治疗，采用膳食营养干预对于AD预防和治疗具有重要意义。

白皮杉醇(piceatannol，PIC)是一种存在于多种可食用植物(蓝莓、葡萄、百香果等)中的天然多酚类化合物。PIC具有多种健康提升功能，如抗肥胖、抗糖尿病、神经保护、心脏保护、抗过敏、抗衰老等[10-11]。有研究表明，在细胞模型中，PIC可以通过激活α-分泌酶和基质金属蛋白酶-9有效地降低β淀粉样蛋白水平[12]。此外，PIC还被发现对Aβ诱导的神经突碎片有保护作用并抑制神经元凋亡[13]，可以通过提升线粒体功能保护神经细胞免于氧化损伤[14]。然而，关于PIC在AD改善方面的研究多停留在细胞水平，PIC能否在动物机体水平发挥相应认知保护功能尚需进一步明确；
同时PIC对AD小鼠认知保护作用也需要进一步确认。本研究拟探讨PIC对AD小鼠认知障碍和氧化应激反应的影响，以期为PIC辅助预防和治疗AD提供理论依据。

1.1 实验动物

雄性无特定病原体级的雄性昆明小鼠72只，7～8周龄，体质量(20±2) g，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司。饲养期间，保持良好通风，自由饮水、进食标准小鼠饲料，室内适度通风、室温25 ℃、湿度60%±5%，采用12 h/12 h昼夜间断照明。

1.2 材料与试剂

PIC(质量分数≥98%)，购自上海源叶生物科技有限公司；
D-半乳糖(D-galactose，D-gal)、三氯化铝(AlCl3)，购自国药集团化学试剂有限公司；
二甲基亚砜(DMSO)，购自上海拜力生物科技有限公司；
盐酸多奈哌齐(Donepezilhydrochloride)，购自卫材(中国)制药有限公司；
丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)检测试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；
Aβ1-42淀粉样蛋白试剂盒、肿瘤坏死因子(TNF-α)试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；
抗Iba1多克隆抗体，购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；
尼氏(Nissl)染色液，购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 仪器与设备

Spark型多功能酶标仪，瑞士Tecan公司；
CR22N型低温高速离心机，德国Eppendorf公司；
EXF24086型- 80 ℃超低温冰箱，美国Thermo Fisher公司；
CLYS2- AO型组织匀浆机，法国Bertin公司；
ZS-001型Morris水迷宫视频分析系统，北京众实迪创科技发展有限责任公司；
IX72型荧光正置显微镜，日本Olympus公司。

1.4 实验方法

1.4.1AD小鼠模型构建

将72只小鼠随机分为6组, 每组12只, 即正常对照组(Control)、模型对照组(AD Model)、阳性对照组(Donepezil)、白皮杉醇低剂量干预组(50 μg/mL，PIC-L)、中剂量干预组 (100 μg/mL，PIC-M)和高剂量干预组(200 μg/mL，PIC-H)。除Control，其余各组小鼠采用AlCl3和D-gal联合诱导的方法，连续给药70 d，构建阿尔茨海默病小鼠模型。造模期间每天早上9:00给药，根据体质量按照20 mg/kg的剂量灌胃AlCl3，120 mg/kg的剂量腹腔注射D-gal。AlCl3溶解于超纯水，D-gal溶解于生理盐水，PIC溶解于0.5%羧甲基纤维素钠溶液。Control小鼠灌胃同体积0.5%羧甲基纤维素钠溶液。实验模型构建35 d后，每日灌胃不同剂量PIC干预组小鼠相应的PIC剂量，连续干预35 d。Donepezil按4 mg/kg灌胃盐酸多奈哌齐溶液。盐酸多奈哌齐是一款处方药物，适应症为轻度或中度AD症状的治疗。所有的实验都得到了北京大学实验动物中心动物伦理委员会批准(伦理号：LA2018143)。

1.4.2Morris水迷宫实验

造模后给予小鼠5 d水迷宫训练，并通过定位航行和空间探索了解本实验小鼠的各项功能。水迷宫装置由圆形水箱(高度50 cm、直径120 cm)组成，实验进行前，在第三象限的固定位置放置一个隐形逃生平台。通过安装于水池正上方中心位置的Morris软件视觉跟踪系统追踪记录小鼠的活动轨迹，计算小鼠到达平台的时间和游泳距离作为逃避潜伏期，本实验逃避潜伏期设为60 s。定位航行过程中小鼠学会寻找固定位置的隐藏平台，空间认知的形成可以侧面反映出小鼠的学习能力。在Morris水迷宫测试6 d后，撤去水中的隐藏平台，对小鼠进行为期1 d的空间探索实验。选择距离原平台最远的入水点将小鼠面向池壁放入水池中，记录其在60 s内的游泳轨迹、在目标象限的活动时间和穿越平台次数用于评估小鼠的记忆能力。

1.4.3脑组织生化指标检测

取脑组织于冰上，加入0.2 mL蛋白裂解液后，将其充分研磨至无絮状物产生。随后利用ELISA试剂盒检测神经炎症因子TNF-α水平和Aβ1-42蛋白水平。

1.4.4血清氧化应激指标检测

行为学实验后所有小鼠在禁食12 h后进行麻醉处理，通过眼眶取血，得到的全血于室温下静置35 min后离心(3 000 r/min、4 ℃、15 min)，分离上清液获得血清，用于MDA、SOD和GSH-Px的测定。

1.4.5免疫荧光染色实验

每组随机选取4只小鼠，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉5 min，固定小鼠后打开胸腔，经心脏灌注0.9%生理盐水排空血液，再灌注质量分数为4%多聚甲醛溶液进行全身各器官固定。将脑取出后浸没于25%的蔗糖PBS缓冲溶液(0.1 mol/L)中固定2 h，4 ℃冰箱中保存。将冰冻切片机干冰预冷，将脑组织从PBS缓冲液中取出，水平置放在冰冻切片机台面上，调整切片厚度为40 μm。取小鼠脑组织切片，采用免疫荧光染色法分析小鼠大脑皮层、海马CAI 区内Iba1表达情况。室温下将脑切片于封闭液中孵育30～60 min，封闭结束后，进行抗体孵育和封片，显微镜下分析观察。

1.4.6相对脏器指数测定

行为学实验结束后所有小鼠在禁食12 h后进行麻醉处理，并迅速解剖小鼠，取全脑、心脏、肝脏、脾脏、肾脏等，将其在预冷的生理盐水中漂洗除去血液，滤纸吸干水分，称重记录并计算各脏器指数[脏器指数为脏器质量(g)与动物体质量(g)的比值]，随后置于液氮中迅速冷冻，于-80 ℃储存备用。

1.5 数据处理

采用SPSS17.0 统计学软件，所有数据均以平均值±标准偏差表示，采用单因素方差分析对多组间数据进行分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 PIC对小鼠学习记忆功能的影响

Morris水迷宫测试常被用来评估小鼠的空间定位学习能力和记忆能力，本研究对小鼠进行了5 d的定位航行实验，结果见图1。由图1可知，测试1 d各组小鼠找到水下隐藏平台的时间相差不大，处于探索阶段。与Control相比，AD Model小鼠的逃避潜伏期从第2天的训练开始表现出显著的增加(P<0.05)，表明AD model小鼠学习能力出现明显的下降；
而Donepezil和PIC-H显著降低了AD小鼠的逃避潜伏期(P<0.05)。从3 d开始，AD model和PIC低、中、高剂量干预组与Control的小鼠逃避潜伏期均无显著差异。训练5 d，AD Model小鼠的逃避潜伏期最长，而Donepezil、PIC干预组均显著改善了这种情况，其中PIC-H组的表现效果最好。将5 d学习期的逃避潜伏期进行横向对比，结果如图2。由图2可知，PIC干预可以有效缓解由D-gal+AlCl3引起的小鼠认知障碍，实验结果均表明PIC可以缓解AD小鼠学习能力的下降。

图2 各组小鼠逃避潜伏期对比Fig.2 Comparison of escape latency of mice in each group

*表示同Control相比存在显著性差异(P<0.05)，#表示同AD Model相比存在显著性差异(P<0.05)。图3 各组小鼠的目标象限活动时间及穿越平台次数Fig.3 Target quadrant activity time and times of crossing platform of mice in each group

在定位航行实验结束的2 d后撤去水中的隐藏平台，对小鼠进行为期1 d的空间探索实验。测定小鼠在60 s内在目标象限的活动时间和穿越平台次数，结果如图3。由图3可知，与Control相比，AD Model小鼠在目标象限的游泳时间显著缩短(P<0.05)，穿越平台次数显著减少(P<0.05)，表明AD Model小鼠记忆功能出现明显的下降。与AD Model小鼠相比，Donepezil和PIC干预组在目标象限的游泳时间没有显著性差异，但PIC-L、PIC-M和PIC-H穿越平台次数显著增加(P<0.05)。与Control相比，PIC-H的平台穿越次数无显著性差异(P>0.05)，表明PIC的摄入可以明显提高AD小鼠的记忆功能，相关表现也可从小鼠的运动视踪轨迹得到印证，结果见图4。以上结果表明，灌胃AlCl3和腹腔注射D-gal造模小鼠表现出明显的学习和记忆能力下降，PIC的摄入可以明显改善AD小鼠的学习记忆功能，表明PIC可以缓解AD小鼠的认知功能障碍。

图4 小鼠运动视踪轨迹Fig.4 Visual tracking trajectory viscera of mouse movement

2.2 PIC对小鼠相对脏器指数的影响

在毒理学评价中脏器指数是评价器官损伤的重要指标，本研究探究了PIC是否对AD小鼠的脏器指数有一定的调控作用。通过称量小鼠全脑、心、肝、脾、双肾的质量，进行脏器质量系数的计算，心、肝、脾、双肾的脏器指数检测结果如表1，全脑指数如图5。由表1和图5可知，各组小鼠的脏器指数没有明显差异，但是AD Model小鼠和PIC-L小鼠的全脑指数显著降低(P<0.05)，可能是灌胃AlCl3和腹腔注射D-gal造模过程中小鼠出现脑组织萎缩的现象，而Donepezil、PIC-M和PIC-H与Control没有显著差异(P>0.05)，表明PIC的摄入改善了AD导致的全脑指数降低的情况。实验结果表明，AD不仅影响认知功能，还影响全脑指数，而PIC能够在一定程度上改善AD小鼠全脑指数的下降，缓解了AD小鼠脑萎缩现象。脑萎缩与认知功能衰退呈正相关，因此实验结果与水迷宫学习记忆功能的行为学评估结果相对应。

表1 各组小鼠相对脏器指数Tab.1 Relative organ index of mice in each group 10-2 g·g-1

*表示同Control相比存在显著性差异(P<0.05)，#表示同AD Model相比存在显著性差异(P<0.05)。图5 各组小鼠全脑指数Fig. 5 Whole brain index of mice in each group

2.3 PIC对小鼠脑组织Aβ1-42含量的影响

Aβ蛋白的聚集是造成AD病理的主要原因之一，而Aβ斑块负荷毒性最大的是Aβ1-42[15]。因此，本实验通过对小鼠脑组织中Aβ1-42蛋白水平进行检测，分析PIC对AD小鼠认知功能的影响，结果如 图6。由图6可知，与Control相比，AD Model和Donepezil小鼠脑中的Aβ1-42含量显著升高(P<0.05)，PIC低、中剂量组脑中的Aβ1-42含量显著升高(P<0.05)，而PIC-H与Control没有显著差异(P>0.05)，说明PIC-H能显著改善AD导致的小鼠脑组织中Aβ1-42毒性蛋白聚集的情况。

2.4 PIC对小鼠脑组织TNF-α表达水平的影响

*表示同Control相比存在显著性差异(P<0.05)，#表示同AD Model相比存在显著性差异(P<0.05)。图6 脑组织匀浆中Aβ1-42的质量浓度 Fig.6 Levels of Aβ1-42 in brain tissue homogenate

TNF-α主要由活跃的巨噬细胞和单核细胞分泌，是一种多效性细胞因子，在免疫功能中起着至关重要的作用。此外，大脑海马区小胶质细胞活化受TNF-α的过度表达调控，引发机体认知功能障碍[16]。脑组织匀浆中TNF-α的水平如图7。由图7可知，与Control相比，AD Model小鼠的脑组织的神经炎症因子TNF-α水平显著升高(P<0.05)。与AD Model相比，PIC低、中、高剂量组中的TNF-α水平均显著降低(P<0.05)，表明摄入PIC可以缓解AD小鼠的炎症反应。

2.5 PIC对小鼠脑组织小胶质细胞的影响

小胶质细胞是中枢神经系统的主要免疫细胞，在维持中枢神经系统稳态中发挥重要的生理作用，其在一定程度上反映了神经元活性，不完全激活或失控的小胶质细胞可能会引发神经毒性作用，分泌促炎因子，从而导致神经退行性疾病[17]。由于PIC干预显著降低脑组织中炎症因子TNF-α含量，鉴于TNF-α通过调控小胶质细胞活化影响机体认知功能作用，提示PIC可能通过降低小胶质细胞的活化改善机体认知功能。各组小鼠脑组织小胶质细胞(Iba1+)的表达水平，结果如图8所示。由图8可知，与Control相比，AD Model小鼠的脑组织中Iba1+呈现出明显的聚集反应，表明AD Model小鼠体内有明显的炎症反应；
与AD Model相比，PIC干预组显著改善了小鼠脑组织中Iba1+的聚集情况，其相对数量均明显减少，证明PIC可以抑制小鼠海马中的炎症反应，其中PIC-H的改善效果更加明显。

*表示同Control相比存在显著性差异(P<0.05)，#表示同AD Model相比存在显著性差异(P<0.05)。图7 脑组织匀浆中TNF-α的质量浓度Fig.7 Levels of TNF-α in brain tissue homogenate

图8 小鼠脑组织小胶质细胞分布Fig.8 Distribution of microglia in mice brain

2.6 PIC对小鼠血清氧化应激指标的影响

氧化应激是指机体在受到各种内外环境的有害因素刺激时，体内产生大量自由基，氧化程度远超出机体对氧化物的清除，造成机体抗氧化和氧化水平失衡，从而造成机体组织器官和细胞的生理及病理损伤[18]。因此，氧化应激反应被认为是由机体超负荷自由基造成的一种负面反应，也是导致AD等神经退行性疾病的至关重要因素[19]。研究表明氧化损伤还会造成线粒体受损加剧[20]，进而引发Aβ和神经纤维缠结，导致突触变性和突触功能紊乱[21]，加快AD病理进程。研究表明机体SOD和GSH-Px能有效清除体内多余的自由基，对于改善机体神经细胞氧化损伤具有重要作用[22]。前期研究表明食品功能因子例如多不饱和脂肪酸以及β-胡萝卜素等都被证实通过提升血清SOD和GSH-Px活力，并降低血清中MDA含量，来减少机体氧化应激水平，改善大脑神经细胞氧化应激损伤[23]。本研究测定小鼠血清中氧化应激关键指标(SOD、GSH-Px及MDA)的水平，结果如图9。由图9可知，与Control相比，AD Model小鼠的SOD活力显著降低(P<0.05)(图9)。与AD Model相比，盐酸多奈哌齐和PIC干预后可以不同程度地改善这种现象，显著提高SOD的活力，并且PIC呈现剂量相关性，表明PIC可以有效提高AD小鼠的抗氧化能力。另外，与Control相比，AD Model小鼠的GSH-Px含量显著降低(P<0.05)，盐酸多奈哌齐和PIC干预可以不同程度地提高血清中GSH-Px的含量，表明PIC可以保护细胞免受过氧化物的损害。此外，在生物体内自由基作用于脂质发生过氧化反应，生成的氧化终产物MDA会对细胞代谢和功能产生重大影响，其含量高低反映了机体的氧化应激水平[24]。与Control相比，腹腔注射D-gal联合灌胃AlCl3导致AD Model小鼠的MDA浓度显著增高(P<0.05)，盐酸多奈哌齐和PIC干预后可以显著降低小鼠血清中MDA的浓度，并且PIC呈现剂量相关性，结果表明PIC可以有效降低AD小鼠体内的氧化应激水平。

*P<0.05表示同Control相比存在显著性差异，# P<0.05表示同AD Model相比存在显著性差异。图9 各组小鼠血清SOD活力及GSH-Px和MDA浓度Fig.9 Enzyme activity of SOD and content of GSH-Px and MDA in each mice group

AD作为常见的神经退行性疾病，其发病率随着人口老龄化而呈指数增长。由于AD的发病机制尚不清楚，目前全球尚没有药物来有效治疗AD。近年来研究表明通过营养干预等手段有助于AD的防控。PIC是在百香果和蓝莓中发现的天然多酚类化合物，具有广泛的生物活性，能够改善由代谢紊乱引起的高血糖症和胰岛素抵抗。在本研究中，通过水迷宫实验表明PIC干预35 d能够显著改善AlCl3和D-gal联合诱导小鼠认知障碍，小鼠空间认知记忆能力得到显著提升。大脑切片免疫荧光分析表明，PIC干预能够显著降低小胶质细胞活化，缓解脑部炎症，脑组织萎缩状况也得到显著改善。脑组织匀浆生化指标测试表明，相对于AD Model，PIC干预能够显著降低脑中Aβ1-42水平，减少脑内Aβ的聚集并降低脑组织中炎症反应TNF-α水平。血液生化指标证实，PIC干预能够显著提升血清中SOD活力和GSH-Px浓度，降低血清中MDA浓度。研究结果表明PIC对于机体认知功能的提升可能通过其提高机体抗氧化能力、降低机体炎症因子的表达来实现的，相关结论旨在为PIC调控机体认知障碍作用提供基础理论依据。

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