吴灶璇 王桂良 肖归 邱萍 徐林芳 龚敏 李兴 文剑波

(1南方医科大学附属萍乡医院消化内科，江西 萍乡 337000；
2海南医学院护理学院)

胰腺癌是预后最差的消化系统恶性肿瘤之一，治疗难度大，病死率高〔1〕。癌基因的异常扩增和表达、抑癌基因的突变或失活及多个基因的协同作用等在胰腺癌的发生中起重要作用〔2〕。热休克转录因子(HSF)1在癌细胞中，通过DNA修复、调节细胞周期、调节能量代谢、调节细胞凋亡和自噬等途径，对促进癌细胞的存活及增殖发挥重要作用〔3〕。自噬在癌形成过程中发挥重要作用，通过感受器和效应器共同调节多途径的生物学过程，在维持细胞自我平衡过程中起重要作用〔4〕。Beclin1是连接自噬与凋亡通道的关键分子，能诱导细胞自噬性死亡及凋亡、抑制炎症扩散、预防基因突变及抑制肿瘤细胞的增殖〔5〕。HSF1和Beclin1均与胰腺癌的发生发展相关，但二者在胰腺癌中表达的相关性及其影响胰腺癌发生发展的机制尚不清楚。本研究通过检测HSF1和Beclin1 mRNA和蛋白在胰腺癌组织、癌旁组织中表达的情况，探讨二者与胰腺癌生物学行为的关系。

1.1患者与试剂 根据采用国际抗癌联盟(UICC)和美国肿瘤联合委员会(AJCC)2017年第6版分期标准，收集南方医科大学附属萍乡医院2015年1月至2020年9月6例新鲜切除的Ⅰ期和Ⅱ期胰腺癌及癌旁组织、196例石蜡标本胰腺癌组织标本，其中包括45例经手术切除的Ⅰ期和Ⅱ期患者和151例不能手术而经超声内镜引导细针穿刺(EUS+FNA)诊断的Ⅲ期和Ⅳ期患者。正常胰腺组织来源于胰腺体尾部β细胞瘤邻近胰腺组织及外伤后经手术部分切除的胰腺组织。临床病理学参数包括性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤位置、淋巴结转移、远处转移、分化程度和TNM分期。研究方案已经过南方医科大学伦理委员会批准。兔抗HSF1、磷酸化HSF1抗体、兔抗Beclin1多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1苏木素-伊红(HE)染色 组织固定、脱水，切片为5 μm厚的薄片，烤片后进行二甲苯脱蜡，常规酒精水化，苏木素染细胞核，伊红染细胞质，进行酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片后进行镜下观察。

1.2.2HSF1和Beclin1免疫组织化学染色 组织经10%甲醛固定后脱水、包埋，切片，微波修复，3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，血清封闭。依次加入一抗、二抗，二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染，常规脱水，透明，中性树胶封片。根据染色强度和阳性细胞百分比来评分进行定性分析。出现棕黄色颗粒沉淀为阳性表达。强度评分：0(无染色)、1(浅黄色)、2(棕黄色)及3分(棕褐色)。比例积分：0(<10%阳性细胞)、1(≥10%且<25%阳性细胞)、2(≥25%且<50%阳性细胞)、3(≥50%且<75%阳性细胞)和4分(≥75%阳性细胞)。强度评分和比例积分相乘产生最终的染色评分：<7分定义为低表达，≥7分定义为高表达。采用 Image-pro plus6.0分析光密度进行定量分析，以积分光密度(IOD)除以面积(Area)计算平均光密度(AOD)，即AOD = IOD/Area。

1.2.3RNA分离和实时荧光定量聚合酶链反应(Rt-PCR) 以Trizole法提取RNA。使用MMLV逆转录，得到cDNA。引物合成及探针修饰由上海生物工程有限公司完成，HSF1扩增引物：正向5′-CCATCCTGCGGGAGAGTGAA-3′，反向5′-GGCTCCGAGCCTGTCAGCA-3′(扩增长度为106 bp)。Beclin1扩增引物：正向5′-GATTGAAGACACAGGAGGCAGT-3′，反向5′-GTGAGGACACCCAAGCAAGAC-3′(扩增长度为97 bp)。GAPDH扩增引物：正向5′-GAAGATCAAGATCATTGCTCCT-3′；
反向5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′(扩增长度为102 bp)。反应条件：95℃ 3 min行变性，95℃循环15 s，56℃ 10 s，72℃下进行45 s，循环35次。然后计算HSF1 mRNA和Beclin1 mRNA的ΔCt值均数和标准差，所有标本的mRNA的相对表达量均经GAPDH校正。

1.2.4Western印迹 称取80～100 mg癌组织，按1∶10的比例加入细胞裂解液，匀浆后离心，取上清液提取总蛋白，用酶标仪定量。按每孔40 μg蛋白量上样，聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，封闭，PVDF膜置于一抗稀释液(1∶1 000稀释)中4℃过夜，洗膜，再置于二抗稀释液(1∶5 000稀释)中室温孵育2 h，洗膜，加入化学发光底物，显影，GAPDH作为内参照，用Quantity One4.3.1凝胶图像分析系统分析蛋白灰度值。

1.3统计学分析 采用SPSS19.0软件进行χ2检验、秩和检验、方差分析、Spearman相关性分析、Pearson相关性分析。采用Log-rank检验比较生存率的差异，以单因素分析和Cox回归分析预后独立影响因素。

2.1HSF1、Beclin1 mRNA及蛋白在新鲜胰腺癌组织、癌旁组织和正常组织的表达 与癌旁组织和正常组织相比，癌组织中总HSF1 mRNA和蛋白、磷酸化(p)-HSF1蛋白及Beclin1 mRNA和蛋白表达均显著升高(均P<0.05)。见图1、表1。

图1 HSF1和Beclin1蛋白在癌组织、 癌旁组织和正常组织中的表达

表1 HSF1和Beclin1 mRNA及蛋白在癌组织、 癌旁组织和正常组织中的表达

2.2HSF1蛋白在石蜡标本胰腺癌组织、癌旁组织和正常组织表达 HE染色显示，正常组织和癌旁组织中可见典型的外分泌腺腺泡结构，细胞排列规则。癌组织中无典型的腺泡样结构，细胞排列不规则，细胞大小不一，边界不清，核大深染，无核仁，腺管呈条索状；
石蜡标本癌组织中，总HSF1蛋白在癌组织中细胞质和细胞核均有表达，主要表达在细胞质，部分表达在细胞核，p-HSF1部分表达在细胞质，有较多的表达在细胞核。在石蜡标本癌旁组织和正常组织中，总HSF1主要表达在细胞质，而细胞核中表达较少，细胞质和细胞核中p-HSF1表达极少。与癌旁组织和正常组织相比，总HSF1蛋白在胰腺癌中的表达显著性升高。HSF1蛋白在不同分化程度的胰腺癌中表达趋势是高分化<中分化<低分化，在不同分期的胰腺癌中表达趋势是Ⅰ期<Ⅱ期<Ⅲ期<Ⅳ期。见图2。

图2 HSF1蛋白在石蜡标本胰腺癌组织、癌旁组织和正常组织中表达(×400)

2.3Beclin1蛋白在石蜡标本胰腺癌组织、癌旁组织和正常组织的表达 Beclin1蛋白主要于细胞质内表达，癌组织中Beclin1蛋白明显高于癌旁组织和正常组织，癌旁组织和正常组织间无明显差异，Beclin1蛋白在不同分化程度的胰腺癌中表达趋势是高分化<中分化<低分化，在不同分期的胰腺癌中表达趋势是Ⅰ期<Ⅱ期<Ⅲ期<Ⅳ期。见图3。

图3 Beclin1蛋白在石蜡标本胰腺癌组织、癌旁组织和正常组织中表达(免疫组织化学染色，×400)

2.4HSF1和Beclin1蛋白表达构成比与胰腺癌患者临床病理学特征的关系 对构成比分析，HSF1与Beclin1蛋白水平均与患者的年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤位置均不相关(P>0.05)，与分化程度、TNM分期、远处转移及淋巴结转移均相关；
HSF1表达与分化级别负相关，与TNM分期正相关，与远处转移及淋巴结转移正相关，Beclin1蛋白表达与分化级别负相关，与TNM分期正相关，与远处转移及淋巴结转移正相关(均P<0.05)。见表2。

表2 HSF1或Beclin1蛋白表达构成比在胰腺癌临床病理参数的关系(n)

2.5HSF1和Beclin1蛋白表达丰度与胰腺癌组织中患者临床病理学参数的关系 HSF1蛋白表达丰度与性别、年龄、肿瘤直径和肿瘤位置不相关(P>0.05)，而与淋巴结转移、TNM分期、远处转移和分化程度相关(P<0.05)。表达趋势是：淋巴结转移(+)>淋巴结转移(-)，远处转移(+)>远处转移(-)，Ⅰ期<Ⅱ期<Ⅲ期<Ⅳ期，高分化<中分化<低分化；
Beclin1蛋白表达丰度与性别、年龄、肿瘤直径和肿瘤位置不相关(P>0.05)，而与淋巴结转移、TNM分期、远处转移和分化程度相关(P<0.05)。表达趋势是：淋巴结转移(+)>淋巴结转移(-)，远处转移(+)>远处转移(-)，Ⅰ期<Ⅱ期<Ⅲ期<Ⅳ期，高分化<中分化<低分化。见表3。

表3 HSF1蛋白或Beclin1蛋白表达丰度与胰腺癌 临床病理参数的关系

2.6HSF1和Beclin1表达相关性 HSF1高表达患者中Beclin1高表达率为71.8%；
HSF1低表达患者中Beclin1低表达率为80.0%，二者呈正相关(r=0.743,P<0.05)。HSF1和Beclin1表达丰度呈正相关(P<0.001)。见图4。

2.7HSF1和Beclin1对胰腺癌预后的危险因素分析 单因素分析显示肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结状态及Beclin1及HSF1表达水平与胰腺癌预后密切相关。进一步多因素Cox回归分析显示淋巴结转移、TNM分期、分化程度、远处转移、HSF1及Beclin1表达水平是胰腺癌预后的独立危险因素。见表4。

2.8HSF1联合Beclin1对胰腺癌患者生存的预测价值 手术治疗的Ⅰ+Ⅱ期患者和不能手术的Ⅲ+Ⅳ期患者的生存率的顺序均为：HSF1(低表达)+Beclin1(低表达)>HSF1(低表达)+Beclin1(高表达)>HSF1(高表达)+Beclin1(低表达)>HSF1(高表达)+Beclin1(高表达)。见图5。

图4 HSF1和Beclin1表达丰度的相关性

表4 HSF1和Beclin1对胰腺癌预后的危险因素分析

图5 HSF1联合Beclin1对不同分期胰腺癌患者生存的预测价值

胰腺癌是一种恶性程度极高的肿瘤，其发生是个多基因、多步骤、多阶段的演变过程，在演变过程中涉及很多基因的表达异常〔1〕。炎症、凋亡、应激、自噬等病理过程也参与了癌症的发生和发展〔6〕。HSF1是和应激相关的一个非常重要的转录因子，在胰腺癌组织中，通过DNA修复、调节细胞周期、调节能量代谢、调节细胞凋亡和自噬等途径，对促进癌细胞迁移、侵袭、增殖和癌细胞新陈代谢发挥重要作用〔7〕。HSF1通过调节Smac激活的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)抑制线粒体凋亡途径，从而促进胰腺癌的发生〔8〕。Ke等〔9〕发现AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)激活的缺失会放大HSF1的活性，从而促进胰腺癌的侵袭和转移。自噬在肿瘤发生与发展中逐渐成为癌症基因靶向治疗的一个新热点〔10〕。多种基因与自噬的发生有关，其中Beclin1是调节细胞自噬中最重要也是最关键的因子之一，HSF1能参与多条信号通路调控自噬相关基因调节自噬调节肿瘤的发生和发展〔11〕，其中对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路是一条关键的通路〔12〕。mTOR同时影响Beclin1的表达，通过与磷脂酰肌醇-3激酶(P13K)形成复合物来调控细胞自噬，这样形成了由P13K、Beclin1、mTOR和HSF1为相互作用的自噬交互调控网络，参与癌细胞正常生理生长、细胞周期演进和自噬〔13〕。研究HSF1与自噬相关基因Beclin1的相关性具有重要意义。

本研究说明，正常胰腺和癌旁组织中HSF1以非激活的形式主要存在于细胞质，而细胞核中很少，在致癌因素的刺激下，部分HSF1被磷酸化而激活转移至细胞核发挥促进肿瘤的作用。HSF1的升高在胰腺癌的发生和进展中起重要作用。HSF1在胰腺癌组织中表达升高的机制尚未完全阐明，一般认为癌细胞在致癌因子的作用下，核因子(NF)-κB、MAPK、mTOR等通路激活，促进HSF1 mRNA转录导致蛋白表达升高〔14〕。HSF1对恶性肿瘤具有多效性作用，对DNA修复、血管生成、代谢、迁移和侵袭及转移中都发挥作用，还能促进局部组织环境的改变以支持肿瘤发展。在之前的研究中，Beclin1在胶质母细胞瘤、肝细胞癌、食管癌、非小细胞肺癌、膀胱尿路上皮肿瘤和乳腺癌中检测到下调〔15～20〕，而在结直肠癌、卵巢癌和胃癌中检测到Beclin1上调〔21～23〕，说明不同癌组织Beclin1表达与临床病理特征的相关性不同。本研究结果说明，Beclin1在胰腺癌组织中表达上调，且Beclin1水平的升高在胰腺癌进展中起着重要作用。Beclin1在肿瘤中的作用是自噬和凋亡细胞死亡途径复杂系列相互作用的结果。本研究结果说明，HSF1、Beclin1均是影响胰腺癌预后的独立危险因素。HSF1高表达且Beclin1高表达利于肿瘤生长，HSF1低表达且Beclin1低表达不利用肿瘤生长。

综上，HSF1、Beclin1在胰腺癌组织中表达升高，且两者之间的表达呈正相关，能独立或协同影响胰腺癌的病程进展，其具体机制尚需进一步研究。

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