金晓立，赖冬红，胡杨妃，丁思思，沈丽珍，陈杨芳，毛晓晔，曾云祥

肺炎克雷伯菌（KP）属革兰阴性杆菌，近年来在社区和医院获得性感染中常见，引起临床关注[1-2]。耐碳青霉烯类（CR）药物是治疗KP有效的广谱抗菌药物，但由于近年临床抗菌药物的滥用，导致KP对CR的耐药率逐渐升高，常表现为多重耐药或广泛性耐药，极易传播。在2014-2019年的我国流行病学调查中可见CRKP的检出率从6.4%上升至10.9%[3]。KP依据细菌的毒力程度可分为高毒力KP和普通KP，高毒力KP较普通KP更容易传播，且更具有侵袭性，可造成严重的系统性感染，危害患者的生命安全[4-5]。既往认为KP的耐药性和高毒力性并不得以共存，而由于临床抗菌药物的不合理使用，耐药及毒力质粒在细菌之间快速传播，高毒力菌株也逐渐开始出现，且逐年增加的趋势，为临床治疗带来了极大困难[6]。目前对于高毒力菌株的定义尚不明确，多认为高黏表型合并携带毒力基因为高毒力菌株，故本研究对浙江省温州地区的老年住院患者临床KP进行分析，探讨CRKP药敏及高黏表型CRKP耐药表型、毒力因子特点，为临床治疗提供辅助信息，报道如下。

1.1 菌株来源 选取2018年3月至2022年3月在浙江省温州市地区各医院收治住院的老年患者（年龄≥60岁）中分离的CR KP菌株，去除同一患者相同部位的重复菌株，共得112株。其中温州市中医院98株，温州市中西医结合医院9株，温州市人民医院3株，温州市泰顺县中医院2株。将收集菌株采用冷冻干燥法进行保存待用。本研究经温州市中医院伦理委员会审核通过。

1.2 试剂和仪器 VITEK-2全自动微生物分析仪及配套药敏卡采自法国生物梅里埃公司，ASLAN-96p实时荧光定量PCR仪采自上海宏石医疗科技有限公司，DYY-6C型电泳仪采自上海标卓科学仪器有限公司，SPX-250B生化培养箱采自上海跃进医疗器械厂，琼脂糖凝胶电泳试剂盒、PCR引物、PCR反应混合液采自上海生工生物技术有限公司，Goldview I型核酸染色剂采自北京索莱宝科技有限公司，菌种接种血平板及肉汤培养基均采自温州康泰生物试剂公司，GeL Documentation基因紫外成像仪采自上海之江生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株鉴定及药敏试验 菌株鉴定均由VITEK-2全自动微生物分析仪进行鉴定，并利用配套药敏卡进行菌株药敏试验，包括亚胺培南、厄他培南、头孢吡肟、头孢替坦、哌拉西林/他唑巴坦等。参照美国临床实验室标准化委员会（CLSI）的标准[7]进行结果判断，质控菌株为KP ATCC700603和大肠埃希菌ATCC25922。

1.3.2 拉丝试验（ST）利用ST检验高黏表型CR KP菌株，将待测菌接种于血平板上，在37℃条件下进行16～18 h的培养后，用接种环轻轻向上挑取菌落，观察黏液丝长度。黏液丝长度＜5 mm或连续3次均未见黏液丝被挑起则为ST阴性；
反之则为阳性，判定阳性为高黏表型菌株。

1.3.3 高黏表型CRKP菌株耐药基因、血清荚膜型、毒力基因检测 采用煮沸法进行DNA模板制备，PCR扩增高黏表型CR KP菌株的碳青霉烯耐药基因、血清荚膜分型及毒力基因。PCR反应条件：94℃，5 min预变性；
94℃变性30 s，退火30 s（各基因序列及退火温度见表1），72℃延伸1 min，72℃再延伸10 min，扩增35个循环。取PCR扩增产物5.0l，用2.0%琼脂糖凝胶电泳（100 mV）检测，反应产物由紫外灯照射观察条带位置和亮度，PCR产物送上海生物工程公司测序，并将序列与美国Blastn公司的分析软件进行分析。

表1 高黏表型CRKP菌株耐药基因、血清荚膜型及毒力基因引物序列及反应参数

1.4 统计方法 以双人核对法进行数据的整理和录入，使用SPSS 21.0统计软件进行分析，计数资料比较采用2检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2.1 CR KP菌株分布情况及药敏结果 112株CR KP分离至112例患者，其中男76例（76株），女36例（36株）；
平均年龄（70.7±13.5）岁，其中＞65岁73例，占比65.18%。分别来源于6种不同的标本类型，其中以尿液（47.32%）和痰液（42.86%）为主，见图1。药敏结果显示，对亚胺培南、厄他培南耐药率均达98.21%，对阿米卡星、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑具有较好的药物敏感性，分别为56.25%、54.46%，见表2。

表2 112株CRKP药敏结果 株（%）

图1 CRKP菌株分布情况

2.2 高黏表型CR KP菌株分布及药敏结果 共检出18株高黏表型CR KP菌株，检出率为16.07%。其中男10例，女8例；
平均年龄（71.9±15.7）岁，其中＞65岁12例，占比66.67%。分别来自3种不同的标本类型，以痰液为主（61.11%），见图2。18株高黏表型CR KP菌株对甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素具有较好的药物敏感性，分别为72.22%、61.11%、55.56%、55.56%，见表3。

表3 18株高黏表型CR KP菌株药敏结果 株（%）

图2 高黏表型CRKP菌株分布情况

2.3 高黏表型CRKP菌株耐药基因、血清荚膜型检测结果 18株CR-HvKP均携带KPC，其中有3株共同携带GES（16.67%），1株共同携带NDM（5.56%）；
血清荚膜型以K1型（11.11%）、K2型（11.11%）为主，有13株未分型，未见K20、K54、K57型，见表4。

表4 高黏表型CR KP菌株耐药基因、血清荚膜型检测结果

2.4 高黏表型CR KP菌株毒力基因检测结果 共有12株高黏表型CR KP菌株携带毒力基因，其中rmpA携带率为61.11%，Iron携带率为61.11%，4株携带aerobactin携带率为22.22%，magA携带率为11.11%，见表5。

表5 高黏表型CR KP菌株毒力基因检测结果

2017年浙江省的CRKP总体分离率达6.2%[8]，而在2021年浙江温州地区的CR KP的分离率高达14.50%，检出率较高，对防治CR KP的临床工作仍任重道远。本研究结果显示，112株CR KP菌株来源以＞65岁的老年患者居多，可能与老年患者多合并基础疾病，身体机能和免疫力下降，住院时间长有关。标本来源以尿液和痰液居多，与其他地区既往研究相似[9]。药敏试验结果显示，本组112株CRKP菌株对亚胺培南、厄他培南抗菌药呈现出高水平耐药，耐药率均高达98.21%，与文献[10-11]结果相似。而对阿米卡星、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑的药物敏感性仍未超过60%，这提示临床应加强抗菌药物的管理，规避不合理用药，以降低KP对碳青霉烯类药物的耐药率。

高毒力菌株可引起多种重要器官的感染，致病性较高[12]。而高黏表型与高毒力密切相关，本研究ST发现，存在18株高黏表型CR KP菌株，检出率为16.07%，与文献[13]结果相近。本次检出的高黏表型CRKP菌株多来源于痰液，可能与老年患者多存在肺部感染有关。药敏结果显示，高黏表型CR KP菌株对亚胺培南、厄他培南、氨苄西林/舒巴坦的耐药率达到了100.00%，符合其高耐药性；
但对阿米卡西和甲氧苄啶/磺胺甲恶唑的敏感性超过了60%，这提示临床治疗高黏表型CR KP菌株感染可优先考虑此类药物。本研究显示，高黏表型CR KP菌株均携带KPC基因，携带率达100%，与文献[14]结果相近。这说明高黏表型CR KP菌株的主要耐药机制为产KPC型碳青霉烯酶，这也是对氨基糖苷类、磺胺类药物的敏感性较好的原因之一。细胞荚膜K1和K2型被认为是具有高毒力的荚膜血清型，本研究显示，18株高黏表型CRKP菌株细胞荚膜型检出以K1和K2检出为主，与文献[15]结果一致。这可能也是其对碳青霉烯酶类药物产生高耐药性，更易发生感染迁徙的原因。

本研究发现，共有12株高黏表型CR KP菌株携带毒力基因，其中以携带rmpA、Iron基因为主。rmpA为KP高黏表型调节因子，可激活荚膜的合成，有增强菌株毒力的作用，既往也有研究显示高毒力KP分离株中多见rmpA基因的存在[13-14]。Iron和aerobactin均为KP分泌的铁载体，介导者细菌与宿主细胞的黏附，既往多以aerobactin基因多见，但在本研究中仅4株携带aerobactin，文献[15]研究结果不一致，这可能与地区不一有关。

综上所述，高黏表型CRKP菌株在温州地区老年住院患者中的检出率较高，标本主要来源于痰液，耐药基因机制可能为产KPC型碳青霉烯酶，血清荚膜型以K1和K2为主，毒力基因以rmpA、Iron基因携带率最高。

利益冲突 所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明 金晓立：实验操作、论文撰写；
曾云祥：实验设计、论文修改；
赖冬红：样本收集、实验操作；
胡杨妃、丁思思：数据整理、统计学分析；
沈丽珍、陈杨芳、毛晓晔：实验指导、菌株提供

猜你喜欢荚膜青霉毒力12种杀菌剂对三线镰刀菌的室内毒力测定云南化工(2021年6期)2021-12-21羊毒素型产气荚膜梭菌临床症状及病理变化兽医导刊(2021年15期)2021-01-10阿维菌素与螺螨酯对沾化冬枣截形叶螨的毒力筛选及田间防效研究农药科学与管理(2019年6期)2019-11-23肺炎链球菌荚膜教学标本的制作方法研究中国当代医药(2019年36期)2019-02-11陕西省部分地区鸡源A型产气荚膜梭菌分离株的药敏试验动物医学进展(2015年10期)2015-12-07水稻白叶枯病菌Ⅲ型效应物基因hpaF与毒力相关华南农业大学学报(2015年5期)2015-12-04碳青霉烯类抗生素耐药机制的研究进展中国当代医药(2015年26期)2015-03-01三种方法联合检测在非HIV感染儿童马尔尼菲青霉病的临床应用现代检验医学杂志(2015年4期)2015-02-06产IMP-1型碳青霉烯酶非脱羧勒克菌的分离与鉴定现代检验医学杂志(2015年2期)2015-02-06拮抗扩展青霉菌株的筛选及其抗菌活性物质分离食品工业科技(2014年9期)2014-03-11