张 赫，尤梦瑶，万 璐，闫佳佳，刘松梅，郑春英

（1黑龙江大学/农业微生物技术教育部工程研究中心，哈尔滨 150500；
2黑龙江大学生命科学学院/黑龙江省普通高校微生物重点实验室，哈尔滨 150080）

刺五加为五加科植物刺五加(Acanthopanax senticosus)的干燥根及根茎或茎，具有益气健脾、补肾安神的功效[1]，是药食两用功能性保健食品。刺五加富含苷类[2]、黄酮[3]、多糖[4]、有机酸、木脂素、香豆素[5]等多种活性化学成分，具有抗疲劳[6]、抗炎[7]、抗肿瘤[8]、抗抑郁[9]、降压[10]、保肝[11]、降糖[12]等作用，广泛用于医药和食品行业。

刺五加主产于黑龙江，寒地黑土造就了刺五加的特有品质，现已成为寒地龙药的领军品种，享誉国内外。刺五加需求量上涨，森林面积逐渐减少以及盲目的采挖，使刺五加资源面临考验，目前刺五加是国家二级濒危物种，三级重点保护品种[13]。尽管栽培种植在某种程度上缓解了刺五加的使用，但刺五加生长周期长，种植户资金回笼慢，寻找生产刺五加次生代谢产物的新方法已成为研究热点。

植物内生菌可以产生与宿主植物相同或相似的次生代谢产物[14]，将甘草内生菌作为发酵菌株，采用微生物发酵法生产刺五加次生代谢产物，对开发新资源、生产新型保健食品及开发新药具有重要意义。笔者以分离自刺五加根部的内生真菌CJ7为研究对象，对其进行次生代谢产物筛选及抑菌活性研究，并对其发酵工艺进行优化；
同时，对其进行菌种鉴定，旨在为采用微生物发酵法生产刺五加次生代谢产物提供参考。

1.1 材料与试剂

供试菌为内生真菌CJ7，分离自黑龙江省帽儿山区野生刺五加根部；
NA、PDA培养基配制方法参阅文献[15-16]；
金黄色葡萄球菌等11株受试菌购于黑龙江省微生物研究所；
ITS序列通用引物ITS1、ITS4由上海生物工程有限公司合成；
除液相用甲醇为色谱纯级别，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

FL2200型高效液相色谱仪（浙江温岭福立分析仪器有限公司），HZQ-C空气浴振荡器（哈尔滨市东明医疗仪器厂）。

1.3 方法

1.3.1 发酵液的制备 无菌条件下，取已活化的内生真菌CJ7，加无菌水适量，制成1×107CFU/mL种子液；
取CJ7种子液，以2%(v/v)接种至装液量为50 mL PDA培养基后，置于空气浴摇床中培养14天(28℃，140 r/min)，终止发酵，抽滤，取滤液，作为发酵液供试品备用。

1.3.2 内生真菌CJ7发酵液活性成分分析 HPLC检测条件：VenusilXBP-C18柱(4.6mm×250mm，5μm，USA)，流动相为甲醇-水-冰醋酸(15:85:1)，流速1 mL/min，柱温25℃，检测波长269 nm。

（1）供试品液的制备。取“1.3.1”发酵液供试品10 mL，减压回收至干(50℃，0.1 MPa)，加1 mL甲醇溶解后，过滤（0.22 μm微孔滤膜过滤），取滤液作为供试品溶液。

（2）对照品液的制备。精密称取紫丁香苷对照品适量，加甲醇溶解后，使紫丁香苷形成1 mg/mL的对照品溶液备用。

（3）空白对照品液的制备。取PDA培养基10 mL，同“1.3.2（1）”法制成空白对照品液。

（4）分别取供试品液、对照品液及空白对照品液各10 μL注入HPLC仪器进行分析。

1.3.3 内生真菌CJ7抑菌活性分析 取“1.3.1”发酵液，冻干，称取适量，加甲醇溶解后制成0.1 mg/mL甲醇提取物，分别以100 μg/mL链霉素和制霉素作为阳性对照，以甲醇溶液为空白对照，参阅文献[17]，采用琼脂扩散法对内生真菌CJ7发酵液进行抗菌活性分析。

1.3.4 内生真菌CJ7发酵条件优选

（1）单因素实验。

①接种量对抑菌活性的影响。取“1.3.1”1×107CFU/mL种子液分别依次按1%、2%、3%、4%、5%(v/v)比例接种到50 mL初始pH 7.0的PDA培养基中，发酵培养8天(28℃，120 r/min)，按“1.3.3”测定发酵液对鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baummanii)抑菌活性(n=3)。

②装液量对抑菌活性的影响。将“1.3.1”1×107CFU/mL种子液以2%(v/v)的接种量分别接入到装有20、30、40、50、60 mL初始pH 7.0的PDA培养基中，发酵培养8天，其他操作同“1.3.4（1）①”。

③初始pH对抑菌活性的影响。将“1.3.1”1×107CFU/mL种子液以2%(v/v)的接种量接入到装有50mL初始pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的PDA培养基中，发酵培养8天，其他操作同“1.3.4（1）①”。

④发酵时间对抑菌活性的影响。将“1.3.1”1×107CFU/mL种子液以2%(v/v)的接种量接入到装有50mL初始pH 7.0的PDA培养基中，分别发酵培养4、6、8、10、12天，其他操作同“1.3.4（1）①”。

⑤摇床转数对抑菌活性的影响。将“1.3.1”1×107CFU/mL种子液以2%(v/v)的接种量接入到装有50mL初始pH 7.0的PDA培养基中，分别发酵培养8天，摇床转数分别为100、120、140、160、180、200 r/min，其他操作同“1.3.4（1）①”。

⑥发酵温度对抑菌活性的影响。将“1.3.1”1×107CFU/mL种子液以2%(v/v)的接种量接入到装有50mL初始pH 7.0的PDA培养基中，发酵培养，摇床温度分别设定为24、26、28、30、32℃，其他操作同“1.3.4（1）①”。

⑦碳源对抑菌活性的影响。分别选用2%(m/v)的葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、蔗糖做为碳源制备“1.1”PDA培养基，并将“1.3.1”1×107CFU/mL种子液以2%(v/v)的接种量分别接入到装有50 mL初始pH 7.0的培养基中，发酵培养8天，其他操作同“1.3.4（1）①”。观察不同质量浓度的碳源对抑菌活性的影响(n=3)。

⑧氮源对抑菌活性的影响。分别选用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、豆粉、(NH4)2SO4为氮源，加入到“1.1”PDA培养基中，其他条件及发酵培养同“1.3.4（1）①”。观察不同质量浓度的氮源对抑菌活性的影响(n=3)。

（2）正交实验。根据单因素实验筛选结果，选取碳源浓度、氮源浓度、接种量和发酵时间4个因素作为实验因素，采用[L9(34)]正交实验设计优化发酵条件，因素水平见表1。

表1 正交实验因素和水平

1.3.5 内生真菌CJ7的鉴定

（1）内生真菌CJ7形态学观察。参阅文献[18]，观察CJ7于平板PDA培养基（28℃，8天）上菌落形状、颜色、浓密程度、基内菌丝形态及是否产色素等；
同时，取CJ7 PDA平板（培养3天），将无菌盖玻片倾斜扦入该平板中，继续培养5天后取出，镊取盖玻片，置显微镜下观察，初步确定菌株的分类地位[19]。

（2）内生真菌CJ7 ITS序列分析。参阅文献[20]的方法提取菌株CJ7 DNA，PCR产物纯化，测序（委托上海生工生物工程股份有限公司完成）。所测得序列提交GenBank数据库，利用MEGA7构建系统发育树，确定CJ7菌株的分类地位。

2.1 内生真菌CJ7发酵液活性成分分析

由图1可知，在内生真菌CJ7发酵液中，在与紫丁香苷对照品相应的保留时间位置出现相同的色谱峰，而且色谱峰经过对照品加入法得到了较好确认，且空白对照无干扰。由此说明，内生真菌CJ7为紫丁香苷产生菌。

图1 CJ7发酵液活性成分分析结果

2.2 内生真菌CJ7抑菌活性分析结果

由表2可以看出，刺五加内生真菌CJ7对10株致病细菌均有一定的抑制作用，尤其对鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baummanii)抑制作用最强。

表2 CJ7抑菌活性分析结果mm

2.3 内生真菌CJ7发酵条件优选结果

2.3.1 单因素实验结果

（1）接种量对抑菌活性的影响结果。由图2可知，随着CJ7接种量的增加，其发酵液的抑菌活性逐渐增强，当接种量在2%时，CJ7的抑菌活性达到最强，此后抑菌活性开始减弱。可能是由于CJ7接种量的增加使菌株生长密度增大，不利于抑菌活性物质的产生。

图2 接种量对抑菌活性影响

（2）装液量对抑菌活性的影响结果。由图3可以看出，装液量在20%～40%范围变化时，CJ7抑菌活性逐渐增强，当装液量持续增加时，抑菌活性开始减弱，这与溶氧量有关，适度的溶氧量可以促进抑菌活性的产生。

图3 装液量对抑菌活性影响

（3）初始pH对抑菌活性的影响结果。由图4可以看出，当发酵液初始由pH 4.0增至pH 8.0时，CJ7抑菌活性出现先增强后减弱的趋势，当初始pH 7.0时，发酵液抑菌活性最强，抑菌圈直径为(23.32±0.04)mm左右，此后，随着初始pH的增加，CJ7抑菌活性开始出现减弱。上述结果说明，CJ7最适初始为pH 7.0。

图4 初始pH对抑菌活性影响

（4）培养时间对发酵液抑菌活性的影响。由图5可知，在不同的发酵时间下，CJ7的抑菌活性表现出先增强后减弱的趋势，这可能是由于CJ7菌株在发酵时间内处于不同生长期，产生次生代谢产物的量有所不同。当培养时间为8天时，CJ7的抑菌活性最强。

图5 发酵时间对抑菌活性影响

（5）摇床转数对抑菌活性的影响结果。由图6可知，CJ7的抑菌活性随摇床转数的增长表现出先增强后减弱的趋势，当摇床转数为120 r/min时抑菌活性最强，但摇床转数过快也会影响CJ7菌株的正常生长，这与摇床转速协同装液量完成液态培养基中氧的溶解有关。

图6 摇床转数对抑菌活性影响

（6）发酵温度对抑菌活性的影响结果。由图7可以看出，CJ7的抑菌活性随发酵培养的温度增加而呈现先增强后减弱的趋势，但发酵温度为28℃时其抑菌活性最强。由此说明，发酵温度过低或过高都不利于CJ7抑菌活性物质的产生。

图7 发酵温度对抑菌活性的影响

（7）碳源对抑菌活性的影响结果。由图8可知，不同碳源对菌株CJ7抑菌活性不同，当选取葡萄糖为碳源时，CJ7菌株的抑菌活性最强，因此选用葡萄糖作为培养基的碳源。

图8 碳源质量浓度对发酵液抑菌活性影响

（8）氮源对抑菌活性的影响结果。由图9可知，CJ7的抑菌活性与氮源的选择和浓度有关，当牛肉膏作为氮源时，CJ7菌株发酵液的抑菌活性最强，因此选用牛肉膏作为培养基的氮源。

图9 氮源对抑菌活性影响

2.3.2 正交实验结果 由表3～4可知，影响CJ7抑菌活性的因素顺序为碳源质量浓度＞氮源质量浓度＞接种量＞发酵时间，其中碳源质量浓度对CJ7抑菌活性的影响极显著，氮源质量浓度对抑菌活性影响显著，接种量和发酵时间对抑菌活性无显著影响，CJ7的最优发酵条件为A2B3C2D2，即氮源（牛肉膏）质量浓度2%，碳源（葡萄糖）质量浓度2.5%，接种量为2%(v/v)，培养8天。综合单因素实验结果，CJ7最佳发酵条件为2%牛肉膏，2.5%葡萄糖，接种量2%，装液量40%，初始pH 7.0，培养8天，摇床转数120 r/min。

表3 正交实验结果

表4 方差分析

分别采用最佳发酵条件及“1.3.1”项发酵条件将内生真菌CJ7发酵培养后进行抑菌实验，结果表明，采用最佳发酵工艺条件培养CJ7后，其抑菌活性为(30.83±0.15)mm，比未经优选发酵工艺组的抑菌活性高4.32 mm。

2.4 内生真菌CJ7的鉴定结果

2.4.1 内生真菌CJ7形态学观察结果 CJ7菌落在培养7天后，菌落直径为8 cm左右，白色，渐变成灰绿色，中心凸起，菌落致密，毯状、全缘，无渗出物（图10A）；
CJ7产分生孢子，头呈圆柱状，梗细长、无分支，上部有膨大顶囊，其表面布满放射状的小梗，小梗着生单轮，上有球形分生孢子（图10B）。

图10 内生真菌CJ7形态学观察结果

2.4.2 内生真菌CJ7 ITS序列分析结果 刺五加内生真菌CJ7 DNA PCR扩增后获得1条550 bp的特异性条带，将测序结果在GenBank中进行Blast同源性比对，然后用MEGA7软件构建系统发育树（图11），内生真菌CJ7序列与曲霉属烟曲霉(Aspergillus fumigatusFJ810102.1)的相似性达到98%，序列的同源相似性为99%。综合CJ7形态学观察结果，将刺五加内生真菌CJ7鉴定为烟曲霉。

图11 内生真菌CJ7系统发育树

从刺五加根部分离得到1株可以产紫丁香苷的内生真菌CJ7，紫丁香苷是刺五加的指标性成分，具有抗炎[21]、抗肿瘤[22]及神经保护[23]等多种活性。此外，该菌株具有较好的抑菌活性，其发酵工艺经优化后，最佳发酵条件为培养基中葡萄糖质量浓度2.5%，牛肉膏质量浓度2.0%，初始pH 7.0，装液量40%，接种量2%，培养8天，摇床转数120 r/min，发酵温度为28℃。以抑菌圈的直径作为抑菌作用指标，在上述条件下，CJ7抑菌活性比未优化前提高了4.32 mm；
内生真菌CJ7鉴定为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)。

近年来，关于刺五加内生菌的研究工作逐渐增多，但大多集中于刺五加内生细菌[24]、内生真菌[25]及内生放线菌[26]的分离鉴定及抑菌[27]、抗氧化[28]等方面，且进行刺五加内生菌的分离鉴定工作时没有明确的方向，所分离出的刺五加内生菌仅邢朝斌等[29]将刺五加内生菌株P312-1回接到刺五加植株，回接4个多月后发现，刺五加根部和茎部中刺五加苷B含量出现显著提高，说明刺五加内生菌在其次生代谢产物生物合成过程中起重要的调控作用。

笔者基于刺五加次生代谢产物紫丁香苷的生物合成，以紫丁香苷为对照，对刺五加内生真菌CJ7进行次生代谢产物筛选，并对其发酵工艺采用正交实验设计进行了优化，正交实验以直观的方式反映出工艺参数对内生真菌CJ7次生代谢产物紫丁香苷的影响。在工艺筛选过程中，有学者采用响应面法进行优化设计。在今后的研究中，本课题组将进一步运用响应面法对刺五加内生真菌CJ7的次生代谢产物筛选及发酵工艺进行优化，将为开发利用刺五加内生真菌CJ7，并采用微生物发酵法生产紫丁香苷提供参考。

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