闫涵 于昕喆 张春腾 李军 郑大勇

1华北理工大学药学院 河北唐山 063210；
2辽宁中医药大学中医学院

恶性肿瘤已成为严重威胁我国居民健康的主要公共卫生问题，根据最新的统计数据显示恶性肿瘤死亡占居民全部死因的23.91%[1]。近年来，随着我国人口老龄化日益加剧，吸烟、饮酒等不健康生活方式、食品安全、空气污染等危险因素的累加，恶性肿瘤的发病率和死亡率均呈持续上升趋势。肺癌、肝癌、结直肠癌及上消化系统肿瘤、女性乳腺癌是我国发病率和死亡率较高的恶性肿瘤[1]，而肿瘤难以控制的主要原因表现在频繁出现的肿瘤转移。

Twist1是一种高度保守的含碱性螺旋-环-螺旋结构域(basic helix-loop-helix, bHLH)的转录因子，最初在果蝇胚胎中发现，Twist1基因突变的果蝇胚胎因无中胚层而无法正常成熟，并在胚胎生长结束时以“扭曲(Twist)”的外观死亡，因而得名[2-3]。Twist1在胚胎发育中起关键作用，Twist1的功能丧失可导致遗传性的Saethre-Chotzen综合征，表现为身材矮小、颅缝早闭等[3]。近年来，针对Twist1与肿瘤生物学行为进行了大量研究，特别是发现Twist1在肿瘤转移中起关键性作用[4]。

人Twist1基因定位在染色体7q21.2上，包含两个外显子和一个内含子[3]，外显子1含有一个编码202个氨基酸的开放阅读框，而外显子2不编码蛋白。Twist1是进化上高度保守的bHLH家族的转录因子，相对分子量约为21 kDa。在bHLH结构域上包含一段碱性氨基酸，后面与两个两亲性α-螺旋相邻，这两个α-螺旋由一个螺旋环隔开[3]。bHLH蛋白需作为二聚体识别并结合六个核苷酸序列CANNTG，即Ndel1 E-box顺式调控元件，进而在细胞核中起到转录因子作用。此外，Twist1蛋白的碱性氨基酸区域Q109-T121是结合DNA的主要区域，有两个核定位信号序列(nuclear localization signal sequences 1 and 2, NLS)，分别为37RKRR40和73KRGKK77。

Twist1作为转录因子直接调节其靶基因，还通过与其他转录调节因子相互作用调节其他转录因子或共调节因子介导相关基因表达，比如参与调控FGF(fibroblast growth factor)和SHH(sonic hedgehog homolog)信号通路[5]。此外，Twsit1与细胞自噬相关标志物SQSTM1/p62结合，抑制Twist1降解[6]；
TNFα激活NF-κB可上调Twist1的表达，抑制细胞凋亡；
转录组学分析发现蛋白激酶D1(protein kinase D1, Prkd1)是Twist1的直接转录靶点，而Prkd1被Twist1激活后将调节多种细胞进程，包括细胞增殖和细胞转移[7]。另外，Twist家族的另一个成员Twist2包含160个氨基酸，与Twist1具有68%的同源性。

Twist1过表达参与了包括乳腺癌、肝癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、结直肠癌和胰腺癌等多种类型肿瘤的恶性进展[4]。Twist1可调控致癌基因诱导的细胞增殖和抑制细胞凋亡，增加肿瘤细胞对化疗药物的耐药性，以及提升肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs)群体数量，并促进癌细胞侵袭和转移[8-9]。最新的研究更明确了Twist1在促进肿瘤细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)和转移中的作用[8]。Twist1在转移的各个步骤均起到关键作用，比如：EMT、局部侵袭、血管浸润、循环系统转运、溢出、继发器官部位存活与增殖，以及形成显著的转移性病变。Twist1作为EMT相关的转录因子，可增强原发性肿瘤细胞的EMT发生。然而，在促进肿瘤的发生、发展及肿瘤转移过程中，Twist1对不同类型肿瘤的表达、功能和分子机制有所不同。

2.1Twist1与乳腺癌 乳腺癌(breast cancer, BC)是一种高度异质性疾病，根据分子谱分析将BC分为五种亚型：管腔A型(Luminal A)、管腔B型(Luminal B)、HER2(human epidermal growth factor receptor 2)阳性、基底样型和三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC)。Twist1是在高淋巴结转移临床分期的乳腺癌中过表达，与乳腺癌EMT呈正相关。特别是Twist1在TNBC患者中显著高表达，与肿瘤体积、淋巴结受累及较差的无远处转移生存率密切相关。同时，Twist1与p53突变、E-cadherin及Ki67呈正相关。相反，野生型p53可促进Twist1蛋白降解并抑制EMT，维持上皮表型[10]。

Twist1过表达与预后不良的基底样乳腺癌相关，在雌激素受体阳性的管腔型乳腺癌细胞中，Twist1可下调FOXA1(forkhead box protein A1)表达，并减少了FOXA1抑制的细胞转移[11]。使用流式细胞荧光分选技术对基底型乳腺癌MCF10AT1细胞进行乳腺癌CSC的分类研究，发现Twist1是激活乳腺癌CSC的上游调节因子[12]。同时，STAT3(signal transducer and activator of transcription 3)的活化可增加Twist1的表达，研究发现STAT3直接结合Twist1启动子上的第二个近端STAT3结合位点，并激活Twist1转录[13]；
致癌蛋白MUC1-C(mucin 1 C-terminal subunit)可激活STAT3，MUC1-C和pSTAT3共同驱动Twist1转录[14]。MUC1-C/Twist1信号通路使其他EMT相关转录因子如ZEB1和Snail的蛋白表达增加，促进细胞转移。同时，MUC1-C/Twist1通路也增加CSC相关标志物如ALDH1和CD44的表达，促进自我更新和致瘤性。

2.2Twist1与肝细胞癌 肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是一种快速生长的转移性肿瘤。对原发性和转移性HCC的组织微阵列和免疫组织化学检测结果显示，Twist1过表达与肝癌转移呈正相关[15]。Cullin2蛋白是一种E3泛素化蛋白酶复合物的核心组成，是肿瘤抑制蛋白。在HCC细胞中，Twist1结合Cullin2启动子激活其转录，选择性上调Cullin2环状RNA(circ-10720)的表达，并抑制Cullin2蛋白表达和上调波形蛋白(Vimentin)表达[16]。

血管生成拟态(vasculogenic mimicry, VM)也是常见的转移和预后不良因素。HCC组织中Twist1和VM的水平明显高于正常肝组织。Twist1在HCC中上调血管内皮生长因子(VEGF)和N-钙黏蛋白(N-cadherin)表达，提示Twist1在HCC的VM形成中起重要作用。此外，MYBL1(MYB proto-oncogene-like 1)是一种新发现的致癌基因，MYBL1蛋白是强转录激活因子，在癌症的发展中起着重要作用。研究发现MYBL1通过直接靶向Twist1启动子转录而上调Twist1的表达[17]；
长链非编码RNA-重排调节因子(Long intergenic non-protein coding RNA-regulator of reprogramming, Linc-ROR)可促进HCC进展[18]。linc-ROR敲低可下调Twist1的表达，并显著抑制EMT，使HCC细胞对多西他赛的敏感性增加。

2.3Twist1与前列腺癌 前列腺癌的死因主要是出现转移，而雄激素非依赖型转移性前列腺癌对治疗构成巨大挑战。在胚胎发育过程中，Twist1在小鼠前列腺中表达，然后在出生后沉默。Malek等[19]发现Twist1表达在小鼠和人原发性前列腺癌中重新激活，并在转移灶中富集，与生存密切相关。而雄激素非依赖性前列腺癌细胞中Twist1的下调增加了其对去势抵抗治疗的敏感性，并抑制其迁移和侵袭能力；
以上研究提示Twist1重新激活控制上述前列腺癌细胞的生长和转移[20]；
蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)激活后可诱导Twist1和雄激素受体(androgen receptor, AR)表达，在去势治疗抵抗中发挥关键作用[21]。敲低和通过小分子抑制剂来抑制PKC信号转导，阻断NF-κB活性，并抑制Twist1和AR表达。

单胺氧化酶A(monoamine oxidase A, MAOA)通过将Twist1直接结合到白细胞介素6(interleukin-6, IL-6)启动子处的保守E-box元件上，增强IL-6转录，引发炎症反应，并促进肿瘤发生[22]。基质成纤维细胞中的MAOA通过旁分泌IL-6/STAT3信号转导为前列腺癌细胞生长提供优良的肿瘤微环境。

2.4Twist1与肺癌 肺癌近十年来发病率和死亡率增长较快，并且仍然难以治疗。母体胚胎亮氨酸拉链激酶(maternal embryonic leucine zipper kinase, MELK)是一种新的致癌基因，属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员。MELK在肺癌中高表达，与肺腺癌的生存率呈负相关。敲低MELK可下调Twist1的表达，并抑制了肺腺癌细胞转移[23]；
c-ros癌基因1(ROS1)是一种非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)的癌基因。携带ROS1基因突变的A549细胞可诱导EMT发生，上调了Twist1的表达，显著增强A549细胞的运动和侵袭能力[24]。同时，Twist1还介导了NSCLC细胞的EGFR(epidermal growth factor receptor)酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors, TKI)耐药，主要作用机制是由于Twist1直接结合促凋亡BH3基因BCL2L11(BIM)内含子区域和启动子，抑制BIM的转录[25]。

肺肉瘤样癌(pulmonary sarcomatoid carcinoma, PSC)是非小细胞肺癌的一种罕见亚型，目前尚无有效的治疗方法。在PSC组织中发现，PSC表现出EMT和VM表型，以及Twist1表达增加[26]。转化生长因子β1(transforming growth factor-β, TGFβ1)在PSC细胞中诱导EMT和VM形成，并上调Twist1的表达。然而，在Twist1敲低后，在TGFβ1处理的细胞中，EMT发生逆转，VM标志物表达降低，PSC细胞的运动与侵袭能力下降。

2.5Twist1与胃癌 免疫组织化学和RT-PCR分析显示胃癌(gastric carcinoma, GC)组织中Twist1表达水平较高[27]。随后的研究发现，Twist1稳定转染的胃癌细胞具有较强的运动和侵袭能力，并在接种稳转细胞的裸鼠的腹腔和肝脏中可形成更多数量的肿瘤结节。此外，利用基因集富集分析发现G蛋白偶联雌激素受体1(G protein coupled estrogen receptor 1, GPER1)的表达伴随着EMT发生，并与GC中PI3K/AKT通路的激活呈正相关[28]。GPER1的敲低抑制了Twist1的表达，并下调了间质标志物N-cadherin和Vimentin，上调了上皮标志物E-cadherin。另外，Twist1和p53水平呈负相关，进一步提示Twist1为GC细胞增殖和迁移的关键调节因子。

2.6Twist1与结直肠癌 结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是世界上第三大常见的人类癌症。在CRC患者中，较高的Twist1表达水平与远处转移之间存在统计学上的显著相关性，有较差的预后[29]。Twist1过表达增强了有丝分裂畸变，并诱导结肠直肠癌细胞染色体不稳定性(chromosome instability, CIN)[30]。同时，Twist1过表达增强了CIN和DNA损伤，从而提升了侵袭性癌细胞亚群数，并促进了癌细胞转移。

2.7Twist1与胰腺癌 胰腺癌中有超过85%的是胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)，PDAC的侵袭性极强，只有不到7%的PDAC患者有5年生存率。肿瘤代谢重编程对于PDAC发生和发展至关重要。大多数癌细胞依赖有氧糖酵解以支持细胞增殖和抵抗细胞凋亡，这种现象称为“Warburg效应”。最新的研究发现Twist1是PDAC有氧糖酵解的关键调节因子。Twist1的基因沉默可显著抑制PDAC细胞的糖酵解表型，如葡萄糖摄取减少、乳酸产生和细胞外酸化率降低[31]。Twist1可直接促进一些糖酵解相关基因的表达，如SLC2A1、HK2、ENO1和PKM2。

TG相互作用因子1(TG-interacting factor 1, TGIF1)高表达降低了内源性Twist1蛋白和mRNA的表达水平。TGIF1也阻断了Twist1诱导的自转录表达。在体外和体内实验均检测到内源性TGIF1与Twist1启动子的强结合，提示了TGIF1很可能作为Twist1基因的直接转录抑制因子，在PDAC中起肿瘤抑制作用[32]。

2.8Twist1与其他肿瘤 头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)发生在包括口腔、喉部和咽部的恶性鳞状细胞病变，是世界上第六大常见癌症。多数HNSCC患者在局部晚期或转移阶段确诊，且5年生存率很低。在HNSCC组织中检测到蛋白精氨酸甲基转移酶5(protein arginine methyltransferase 5, PRMT5)的表达，而PRMT5敲低在体外和体内实验中均抑制了HNSCC细胞的恶性表型。PRMT5可靶向Twist1启动子区域，随后激活Twist1的转录，促进了HNSCC的恶性进展[33]。在侵袭性口腔鳞状细胞癌中， Twist1和集落刺激因子(colony stimulating factor 1, CSF1)在转移组织中的表达增高[34]。Twist1过表达可诱导CSF1的激活，而Twist1基因沉默则下调CSF1，降低细胞侵袭能力。

在高表达Twist1的食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)细胞中，细胞运动与迁移能力增强，同时上调了基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)的表达[35]。此外，通过RNA-seq和Western blot法分析骨肉瘤组织发现前胶原C-蛋白酶增强蛋白(procollagen C-proteinase enhancer protein, PCOLCE)高表达，并与患者预后不良相关。Twist1也在骨肉瘤组织中过度表达，并且与PCOLCE呈正相关[36]。Twist1上调PCOLCE的表达，在促进骨肉瘤的转移中起关键作用。

肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC)是致命泌尿系统肿瘤。对RCC组织进行qPCR和免疫组织化学检测发现，前胶原-赖氨酸，2-酮戊二酸5-双加氧酶(procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase, PLOD3)在RCC组织和RCC细胞中高表达，而PLOD3可调控Twist1的表达水平[37]。PLOD3敲低可降低Twist1表达，同时下调Twist1介导的β-catenin和AKT信号转导，进而抑制RCC恶性进展。此外，在人宫颈癌组织中发现醛酮还原酶1家族成员C1(aldo-keto reductase 1 family member C1, AKR1C1)高表达，并与宫颈癌患者的临床特征相关[38]。体外实验发现，AKR1C1可增加Twist1的表达和激活AKT通路，以调控宫颈癌细胞的增殖和侵袭。

综上所述，Twist1与大多数类型肿瘤的恶性进展密切相关，参与了肿瘤的转移、VM与血管生成、肿瘤干细胞形成及耐药，而靶向抑制Twist1可能是有效的恶性肿瘤治疗策略。

靶向Twist1可以显著抑制肿瘤生长、限制肿瘤转移、逆转耐药性，从而提高癌症患者的生存率。然而，目前针对Twist1的靶向治疗研究报道较少。Yochum等[39]使用Connectivity Map数据库并利用化学生物信息学方法筛选了Twist1抑制剂，发现去氢骆驼蓬碱(Harmine)可抑制多重Twist1功能。Harmine从药用植物骆驼蓬的种子中提取分离而得，被视为首创新药(First-in-class)的Twist1抑制剂。Twist1及其二聚体E2A蛋白是Twist1介导的下游靶向信号通路所必需的，并且在翻译后调节其他异源二聚体的稳定性[39]。Harmine可优先促进Twist1-E2A异源二聚体的降解。此外，使用NSCLC(包括EGFR、KRAS和MET突变)患者来源的癌细胞构建异种移植小鼠模型，Harmine表现出显著的抗肿瘤活性。同时，Harmine也可克服Twist1而介导EGFR TKI耐药性。

Twist1通过促进EMT增强癌症侵袭与转移，抵抗化疗诱导的细胞凋亡，促进癌症进展和耐药。但是Twist1调控各种类型癌症的发生和发展在分子机制上仍有差异，需进一步研究以确定Twist1参与不同肿瘤类型的作用机制，本文总结了近年来对Twist1参与多种类型肿瘤发生、发展和转移的生物学功能的最新研究进展。随着对Twist1研究的深入，有关Twist1的生物学作用及其在肿瘤进展中的转导途径将逐步确立，会更好的评估Twist1在肿瘤恶性进展中的作用及对不同类型肿瘤提供预后预测和靶向治疗。总之，Twist1可作为肿瘤的生物标志物，用来评估肿瘤的恶性进展情况。同时，Twist1也作为颇有前景的肿瘤治疗靶点，通过寻找适当的小分子抑制剂或者通过基因靶向治疗等方式来抑制Twist1的表达，进而控制肿瘤发展。

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