林海鹏，党旭红，左雅慧

放射性皮肤损伤是由X、γ或β射线外照射引起的皮肤损伤，也是一种放射性职业病。在核燃料循环领域，如乏燃料后处理厂事故情况下，料液泄露可能导致皮肤沾污而引发放射性皮肤损伤；
放射性皮炎是肿瘤放射治疗最常见的并发症。辐射损伤与一般热力烧伤不同，临床表现为发病缓慢、病程长、临床分期明显、全身反应重；
深度放射性损伤创面反复破溃，经久不愈甚至恶变，是典型的难愈性伤口。皮肤成纤维细胞是参与创面修复的主要细胞，其功能正常与否直接影响创面肉芽组织生成和创面愈合［1］。放射性皮肤损伤进程中，辐射诱发皮肤成纤维细胞功能改变的研究对于损伤救治具有重要意义。神经肽P物质（SP）是由11个氨基酸组成的多肽，属于速激肽家族［2］。SP作为神经递质或神经调节剂，在神经系统中起着重要的作用。外源SP可以刺激伤口表面成纤维细胞的增殖和分化，促进血管生成因子和胶原纤维的合成和分泌，在伤口愈合和瘢痕增生中发挥重要作用［3］。本研究旨在探讨外源性SP对放射损伤皮肤成纤维细胞分泌功能及细胞因子表达的影响，以期为放射性皮肤损伤救治提供参考。

1.1材料人皮肤成纤维细胞HFF-1购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。SP（Sigma-Aldrich公司，美国）；
DMEM培养基（Gibco公司，美国），胎牛血清（Biological Industries，以色列）；
胰蛋白酶［生工生物工程（上海）股份有限公司，中国］；
二甲基亚砜（DMSO，Sigma-Aldrich公司，美国）；
RNAsimple总RNA提取试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司，中国］；
实时荧光定量PCR（qPCR）试剂SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ（宝生物工程有限公司，大连）；
Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）、Ⅲ型胶原（Col-Ⅲ）、血管内皮生长因子（VEGF）、降钙素基因相关肽（CGRP）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒［安迪生物科技（上海）有限公司，上海］；
Rotor-Gene 6000荧光定量PCR仪（Corbett Life Science公司，澳大利亚）。

Tab.1 Design of real-time fluorescence quantitative PCR primers表1实时荧光定量PCR引物设计

1.2研究方法

1.2.1细胞培养与分组在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM培养基中，于37℃、5%CO2条件下培养HFF-1细胞至对数生长期。取对数生长期的HFF-1细胞分组传代培养。细胞分为未照射组（0 Gy），照射组（2 Gy、6 Gy、12 Gy、18 Gy），SP干预组（0 Gy+SP、2 Gy+SP、6 Gy+SP、12 Gy+SP、18 Gy+SP）。各实验组细胞传代培养，待贴壁生长后，于照射前12 h更换为含有0.5%胎牛血清的培养基。照射前1 h，向SP干预组细胞培养基中加入SP水溶液，SP终浓度为1×10-7mol/L。

1.2.2细胞照射在冰浴下用医用直线加速器产生的4 MeV电子束照射细胞，吸收剂量率为4 Gy/min，源距100 cm，照射野为20 cm×20 cm。照射剂量分别为0、2、6、12和18 Gy。

1.2.3人皮肤成纤维细胞分泌功能的检测于12孔细胞培养板中接种HFF-1细胞，照射后24 h分别收集各实验组细胞培养基及细胞，参照ELISA试剂盒说明书，分别测定各组培养基及细胞裂解液中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ及CGRP表达量。

1.2.4ELISA法检测人皮肤成纤维细胞中VEGF、bFGF、PDGF蛋白表达水平于照射后24 h，2 000 r/min离心10 min收集各实验组细胞，经磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后超声破碎，12 000 r/min离心10 min收集细胞上清液，参照ELISA试剂盒说明书，分别测定各组VEGF、bFGF及PDGF蛋白表达情况。

1.2.5qPCR检测人皮肤成纤维细胞中VEGF、bFGF、PDGF mRNA表达水平电子束照射后24 h收集各实验组HFF-1细胞。利用RNAsimple总RNA提取试剂盒进行细胞总RNA的提取，并反转录合成cDNA后进行qPCR检测。PCR引物序列见表1。反应体系（25 μL）：SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ（2×）12.5 μL，cDNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O9.5 μL。反应条件：95℃预变性30 s；
95℃变性5 s，60℃退火/延伸20 s，共40个循环。以2-ΔΔCt法计算VEGF、bFGF、PDGF经GAPDH标化后的相对表达量。

1.3统计学方法采用SPSS 21.0软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 SP对放射损伤皮肤成纤维细胞分泌功能的影响

2.1.1 各组HFF-1细胞培养基中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ及CGRP表达水平比较与0 Gy组比较，各照射组（2 Gy、6 Gy、12 Gy、18 Gy组）Col-Ⅰ、Col-Ⅰ/Col-Ⅲ均升高，照射组（12 Gy、18 Gy组）Col-Ⅲ升高，照射组（6 Gy、12 Gy、18 Gy组）CGRP升高。照射前给予SP干预后，与未SP干预的相应组相比：0 Gy+SP组除Col-Ⅲ降低外，各指标水平均升高；
2 Gy+SP组Col-Ⅰ、Col-Ⅰ/Col-Ⅲ降低，Col-Ⅲ、CGRP升高；
6 Gy+SP组Col-Ⅰ、Col-Ⅰ/Col-Ⅲ降低，CGRP升高；
12 Gy+SP组Col-Ⅰ、Col-Ⅲ升高，Col-Ⅰ/Col-Ⅲ降低；
18 Gy+SP组Col-Ⅲ升高，Col-Ⅰ/Col-Ⅲ降低（均P＜0.05），见表2。

Tab.2 Comparison of expression levels of Col-I,Col-Ⅲ,Col-I/Col-Ⅲand CGRP between different culture medium groups表2各组培养基Col-I、Col-Ⅲ、Col-I/Col-Ⅲ、CGRP表达水平比较 （n=3，±s）

Tab.2 Comparison of expression levels of Col-I,Col-Ⅲ,Col-I/Col-Ⅲand CGRP between different culture medium groups表2各组培养基Col-I、Col-Ⅲ、Col-I/Col-Ⅲ、CGRP表达水平比较 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；
a与0 Gy组比较，b与2 Gy组比较，c与6 Gy组比较，d与12 Gy组比较，e与18 Gy组比较，P＜0.05。

组别0 Gy组2 Gy组6 Gy组12 Gy组18 Gy组0 Gy+SP组2 Gy+SP组6 Gy+SP组12 Gy+SP组18 Gy+SP组F Col-Ⅰ（μg/L）14.34±0.25 20.50±0.19a 19.31±0.51a 21.07±0.84a 26.33±0.63a 21.86±0.93a 18.22±0.63b 16.10±0.57c 23.31±1.25d 25.07±0.99 76.684＊＊Col-Ⅲ（μg/L）31.50±0.69 30.14±0.35 32.52±1.18 33.37±0.74a 33.50±0.74a 28.16±1.26a 31.97±0.57b 33.35±1.01 42.24±1.15d 41.37±0.74e 77.852＊＊Col-Ⅰ/Col-Ⅲ0.46±0.02 0.68±0.01a 0.59±0.03a 0.63±0.02a 0.79±0.03a 0.78±0.01a 0.57±0.01b 0.48±0.03c 0.55±0.02d 0.61±0.02e 80.440＊＊CGRP（ng/L）52.48±2.04 53.07±3.50 61.48±1.86a 99.91±4.94a 103.80±2.82a 62.57±4.17a 76.89±4.11b 98.92±2.78c 102.29±3.64 108.88±3.13 135.039＊＊

2.1.2 各组HFF-1细胞内源Col-Ⅰ、Col-Ⅲ及CGRP表达水平比较与0 Gy组比较，各照射组（2 Gy、6 Gy、12 Gy、18 Gy组）CGRP升高，照射组（6 Gy、18 Gy组）Col-Ⅰ、Col-Ⅲ升高，照射组（18 Gy组）Col-Ⅰ/Col-Ⅲ升高（均P＜0.05）。照射前给予SP干预后，与未SP干预的相应组相比：0 Gy+SP组CGRP升高；
2 Gy+SP组各指标水平均降低；
6 Gy+SP组Col-Ⅰ、Col-Ⅰ/Col-Ⅲ降低，CGRP升高；
12 Gy+SP组除Col-Ⅰ/Col-Ⅲ，其余各指标水平均降低；
18 Gy+SP组Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、Col-Ⅰ/Col-Ⅲ降低，CGRP升高（均P＜0.05），见表3。

Tab.3 Comparison of the expression levels of endogenousCol-I,Col-Ⅲ,Col-I/Col-Ⅲand CGRP between the ten groups表3各组细胞内源Col-I、Col-Ⅲ、Col-I/Col-Ⅲ、CGRP表达水平比较 （n=3，±s）

Tab.3 Comparison of the expression levels of endogenousCol-I,Col-Ⅲ,Col-I/Col-Ⅲand CGRP between the ten groups表3各组细胞内源Col-I、Col-Ⅲ、Col-I/Col-Ⅲ、CGRP表达水平比较 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；
a与0 Gy组比较，b与2 Gy组比较，c与6 Gy组比较，d与12 Gy组比较，e与18 Gy组比较，P＜0.05。

组别0 Gy组2 Gy组6 Gy组12 Gy组18 Gy组0 Gy+SP组2 Gy+SP组6 Gy+SP组12 Gy+SP组18 Gy+SP组F Col-Ⅰ（μg/L）38.78±0.53 39.10±0.62 42.98±1.28a 39.69±1.12 43.86±0.71a 37.81±0.49 33.64±0.42b 37.25±0.31c 38.19±0.37d 37.19±0.44e 52.361＊＊Col-Ⅲ（μg/L）73.59±0.66 72.29±0.90 78.70±1.94a 72.84±0.62 78.05±1.83a 72.13±0.90 65.40±1.88b 79.14±1.70 68.44±0.77d 70.83±0.84e 34.876＊＊Col-Ⅰ/Col-Ⅲ0.53±0.01 0.54±0.01 0.55±0.00 0.54±0.02 0.56±0.01a 0.52±0.01 0.51±0.02b 0.47±0.01c 0.56±0.01 0.53±0.00e 14.151＊＊CGRP（ng/L）26.56±0.61 33.53±0.71a 31.10±0.58a 32.55±0.73a 31.48±0.09a 29.52±1.25a 28.81±0.41b 32.70±0.96c 31.07±0.95d 38.15±0.58e 51.309＊＊

2.2 SP对放射损伤皮肤成纤维细胞内源细胞因子表达的影响

2.2.1 各组HFF-1细胞VEGF、bFGF、PDGF mRNA表达水平比较与0 Gy组比较，照射组（2 Gy组）VEGF降低，照射组（6 Gy、12 Gy、18 Gy组）bFGF、PDGF均升高（均P＜0.05）。照射前给予SP干预后，与未SP干预的相应组相比：0 Gy+SP组各指标水平均升高；
2 Gy+SP组VEGF、bFGF升高；
6 Gy+SP组VEGF降低；
12 Gy+SP组和18 Gy+SP组各指标水平均升高（均P＜0.05），见表4。

2.2.2 各组HFF-1细胞VEGF、bFGF、PDGF蛋白表达水平比较与0 Gy组比较，照射组（2 Gy、18 Gy组）各指标水平均升高，照射组（6 Gy组）VEGF升高，照射组（12 Gy组）VEGF、bFGF均升高（均P＜0.05）。照射前给予SP干预后，与未SP干预的相应组相比：0 Gy+SP组和2 Gy+SP组均呈现VEGF升高，bFGF降 低；
6 Gy+SP组VEGF升 高；
12 Gy+SP组VEGF、PDGF升高，bFGF降低；
18 Gy+SP组VEGF、PDGF均升高（均P＜0.05），见表5。

Tab.4 Comparison of mRNA expression levels of VEGF,bFGF and PDGF between the ten groups表4各组VEGF、bFGF、PDGF mRNA表达水平比较（n=3，±s）

Tab.4 Comparison of mRNA expression levels of VEGF,bFGF and PDGF between the ten groups表4各组VEGF、bFGF、PDGF mRNA表达水平比较（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；
a与0 Gy组比较，b与2 Gy组比较，c与6 Gy组比较，d与12 Gy组比较，e与18 Gy组比较，P＜0.05。

组别0 Gy组2 Gy组6 Gy组12 Gy组18 Gy组0 Gy+SP组2 Gy+SP组6 Gy+SP组12 Gy+SP组18 Gy+SP组F VEGF mRNA 1.00±0.00 0.75±0.04a 1.13±0.10 1.09±0.12 1.03±0.03 1.64±0.16a 1.28±0.04b 0.86±0.04c 2.31±0.01d 2.14±0.22e 81.916＊＊bFGF mRNA 1.00±0.00 1.12±0.11 1.70±0.44a 1.51±0.28a 1.65±0.33a 1.55±0.15a 1.65±0.09b 1.55±0.39 1.98±0.04d 2.62±0.32e 8.663＊＊PDGF mRNA 1.00±0.00 1.31±0.06 1.62±0.16a 1.80±0.20a 1.90±0.09a 1.57±0.14a 1.57±0.17 1.54±0.37 2.45±0.45d 2.42±0.27e 11.405＊＊

Tab.5 Comparison of protein expression levels of VEGF,bFGF and PDGF between the ten groups表5各组VEGF、bFGF、PDGF蛋白表达水平比较（n=3，ng/L，±s）

Tab.5 Comparison of protein expression levels of VEGF,bFGF and PDGF between the ten groups表5各组VEGF、bFGF、PDGF蛋白表达水平比较（n=3，ng/L，±s）

＊＊P＜0.01；
a与0 Gy组比较，b与2 Gy组比较，c与6 Gy组比较，d与12 Gy组比较，e与18 Gy组比较，P＜0.05。

组别0 Gy组2 Gy组6 Gy组12 Gy组18 Gy组0 Gy+SP组2 Gy+SP组6 Gy+SP组12 Gy+SP组18 Gy+SP组F VEGF 788.84±41.15 856.82±24.47a 954.71±23.71a 1 090.68±15.14a 1 140.53±24.67a 1 100.65±29.08a 1 174.97±21.75b 1 065.30±40.36c 1 285.55±21.81d 1 317.28±26.13e 112.077＊＊bFGF 24.92±0.28 26.90±0.59a 24.75±0.28 25.93±0.27a 26.92±0.94a 19.77±0.34a 20.34±0.34b 25.33±0.34 22.42±0.22d 27.64±0.36 114.822＊＊PDGF 12.02±0.21 12.50±0.40a 11.74±0.19 12.18±0.22 12.66±0.32a 12.23±0.22 12.83±0.30 11.85±0.21 13.09±0.18d 14.78±0.21e 36.113＊＊

放射性皮肤溃疡创面破溃难愈是其治疗难点。伤口愈合是一个复杂、高度可调的过程，由多种细胞及分子介导，主要包括炎症期、新生组织形成期及组织重塑期［4］。在创面环境的应激条件下，成纤维细胞通过分泌多种信号分子参与调节炎症反应和细胞增殖，通过细胞与细胞的直接通讯以及自分泌和旁分泌的相互作用，从而调节角质形成细胞、内皮细胞和巨噬细胞的功能［1，5］。SP作为局部伤口愈合重要介导因子，可调节成纤维细胞增殖、分泌功能，进而促进皮肤创面愈合［4，6-7］。

真皮成纤维细胞主要通过合成和分泌细胞外基质成分（包括Col-Ⅰ和Col-Ⅲ）在伤口愈合中发挥重要作用。胶原蛋白是组织再生过程中一种重要的细胞外基质，为组织细胞提供支撑，维持其生理结构和功能［4，8］。皮肤真皮中的胶原蛋白主要是Col-Ⅰ和Col-Ⅲ。其表达分泌量不仅决定了真皮修复的进程，其比例也影响真皮瘢痕的结构和功能。在伤口愈合中，Col-Ⅰ的大量出现导致瘢痕结构质地坚硬而缺乏弹性；
Col-Ⅲ是皮肤中网状纤维的主要组成部分，含量越高纤维束越细，在创伤修复中，Col-Ⅲ高表达有利于皮肤组织细腻柔润［9］。本研究通过对细胞培养基中胶原蛋白含量分析来阐述皮肤成纤维细胞对胶原蛋白的分泌功能，结果显示，电子束照射后，与0 Gy组比较，随着照射剂量增加，各照射组细胞培养基中Col-Ⅰ、Col-Ⅰ/Col-Ⅲ升高趋势明显，照射前给予SP干预，发现低照射剂量组（2 Gy、6 Gy组）Col-Ⅰ降低明显，高照射剂量组（12 Gy、18 Gy组）Col-Ⅲ升高明显，但各照射组均呈现Col-Ⅰ/Col-Ⅲ降低，表明外源SP可降低照射后皮肤成纤维细胞中Col-Ⅰ/Col-Ⅲ，提示SP可通过调节Col-Ⅰ/Col-Ⅲ，诱发真皮瘢痕组织结构的改变，有利于皮肤瘢痕软化。为进一步确证上述调节关系，对电子束照射前后及SP干预情况下，细胞胶原蛋白表达情况进行分析表明，电子束照射后，仅高剂量18 Gy组Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、Col-Ⅰ/Col-Ⅲ指标与培养基中表达变化一致，其他剂量组Col-Ⅰ、Col-Ⅰ/Col-Ⅲ指标表达趋势不一致；
外源SP干预后，细胞内Col-Ⅰ和Col-Ⅰ/Col-Ⅲ分别在干预组（2 Gy+SP、6 Gy+SP组）和（2 Gy+SP、6 Gy+SP、18 Gy+SP组）与培养基中表达变化一致。

在伤口愈合过程中，细胞和分子级联过程伴随着多种细胞因子参与。作为首个被批准用于治疗溃疡的生长因子，PDGF可促进平滑肌细胞、成纤维细胞等的分裂，胶原的合成及血管生成。bFGF可促进成纤维细胞、内皮细胞等向损伤部位迁移，加速创面肉芽生长与血管形成，进而改善创伤组织供血环境，缩短创伤愈合时间。VEGF通过刺激血管内皮细胞分裂与增殖，促进微血管新生，提高血管通透性，进而加速伤口愈合［10-12］。Kant等［13］研究表明，局部应用SP可通过对细胞因子、生长因子等的调节，促进伤口愈合。基因调控对外界刺激反映在基因表达的各个环节。本研究结果显示，电子束照射后，仅bFGF在高剂量组（12 Gy、18 Gy组）呈现蛋白和mRNA水平表达变化一致性；
SP干预后，VEGF和PDGF在高剂量组（12 Gy+SP、18 Gy+SP组）呈现蛋白和mRNA一致性高表达，表明细胞因子合成调节可能是皮肤成纤维细胞在应激条件下为减少辐射损伤的一种生物学调节反应，SP可协同皮肤成纤维细胞对辐射照射的应激反应，进而参与伤口创面愈合微环境的调控。

综上所述，SP干预可调节放射损伤皮肤成纤维细胞Col-Ⅰ、Col-Ⅲ表达与分泌，降低Col-Ⅰ/Col-Ⅲ比值，协同成纤维细胞对电子束照射的应激反应，促进放射损伤皮肤成纤维细胞中VEGF、PDGF的高表达。本研究为SP用于放射性皮肤损伤治疗干预提供了数据支持。

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