任意

上海市营养食品质量监督检验站/上海源本食品质量检验有限公司（上海 200090）

随着时代的发展和生活水平的提高，人们越来越注重食物本身的营养价值和作用，同时随着新冠疫情的常态化，增强免疫、提高免疫力成为大家共有的目标。牛奶中除了含有丰富的营养物质之外，还含有众多免疫活性物质，有益人体健康，因此越来越多的人将牛奶列为每日必需品。此外，市面上还有一些宣称具有增强免疫功能的奶粉，添加免疫球蛋白、乳铁蛋白等免疫活性物质，以此吸引消费者购买。免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）就是上述免疫活性物质之一，它是一种具有抗体活性或化学结构与抗体分子相似的球蛋白，为Y字型结构，根据电泳迁移率和免疫功能不同，可分为IgG、IgA、IgD、IgE、IgM。其中，IgG又可分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG44个亚类，IgA可分为IgA1和IgA22个亚类，IgM可分为IgM1和IgM22个亚类。IgG是牛初乳中主要的免疫活性物质，具有抗菌、抗病毒、抗毒素等多种免疫活性[1-3]。

我国现行实施的测定免疫球蛋白的标准有针对保健品和饲料的高效亲和色谱法、牛初乳及其制品的分光光度法和酶联免疫法，其中高效亲和色谱法和酶联免疫法比较常用。酶联免疫法反应灵敏，操作过程中稍有差池就会影响结果[4]，而高效亲和色谱法除了基质针对的是保健品和饲料外，所使用的色谱柱不耐压、易漏液[3]，并且乳及乳制品中含有脂肪和蛋白质，去除不干净会污染检测器且干扰较大，影响定量。试验参考高效亲和色谱法，通过HiTrapTMProtein G HP亲和柱结合免疫球蛋白，采用C18色谱柱进行分离，对牛奶及奶粉中免疫球蛋白的测定进行研究。

1.1 仪器与试剂

LC-20AT高效液相色谱仪（配SPD-M20A二级阵列管检测器，日本岛津）；
HiTrapTMProtein G HP亲和柱（美国GE）；
CAPCELL PAK C18色谱柱（SG300，4.6 mm×250 mm，5 μm，日本大曹三耀）；
Master-D纯水机（上海和泰）；
BSA323S电子天平（精度0.001 g，德国赛多利斯）；
CF16RN冷冻离心机（日本日立）；
SK5200BT超声波清洗器（上海科导）；
BE-2600多管涡旋混合仪（江苏海门市其林贝尔）；
0.45 μm水相针式滤器（聚醚砜，上海安谱）；
0.45 μm亲水PTFE针式滤器（上海安谱）。

磷酸二氢钾、甘氨酸、氢氧化钠、盐酸、磷酸、乙醇等（均为分析纯）；
三氟乙酸、乙腈（均为色谱纯）；
所有试验用水为18.2 MΩ·cm去离子水。

0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.7）[5]：称取6.80 g磷酸二氢钾，加水溶解，用1 mol/L氢氧化钠调整溶液pH至6.7，定容至1 L。

0.05 mol/L甘氨酸盐缓冲液（pH 2.5）：称取3.75 g甘氨酸，加水溶解，用盐酸调整溶液至pH 2.5，定容至1 L。

牛免疫球蛋白G（IgG）标准品（北京美正）：8.5 mg/mL。用0.05 mol/L磷酸盐缓冲液配制成500 μg/mL IgG标准储备液。

超高温灭菌乳、普通奶粉（市售）。

1.2 样品前处理

准确称取20 g牛奶、2 g奶粉（精确至0.001 g）于50 mL刻度离心管中，加入适量0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.7）（奶粉样品可置于不超过35 ℃的温水中进行溶解），振荡混匀，超声提取30 min，冷却后定容至刻度，摇匀，按10 000 r/min冷冻离心10 min。取适量中间液再次按10 000 r/min冷冻离心10 min，取中间液备用。

HiTrapTMProtein G HP亲和柱预先用水和0.05 mol/L磷酸盐缓冲液各10 mL活化，取4 mL备用中间液，通过亲和柱进行净化，用10 mL 0.05 mol/L磷酸盐缓冲液淋洗，用10 mL 0.05 mol/L甘氨酸盐缓冲液洗脱，先弃去前0.5 mL，收集2.5 mL洗脱液，混匀后上液相色谱进行分析，剩余洗脱液全部弃去。亲和柱用水淋洗后封存在20%乙醇中4 ℃保存，可反复使用多次。

1.3 色谱条件

色谱柱：CAPCELL PAK C18色谱柱（SG300，4.6 mm×250 mm，5 μm）。流动相：V乙腈∶V0.1%三氟乙酸= 5∶5。流速1.0 mL/min；
柱温采用室温；
进样量10 μL；
检测波长280 nm；
运行时间10 min。IgG标准品色谱图和加标样品色谱图见图1。

图1 IgG标准品色谱图（左）及加标样品色谱图（右）

1.4 标准曲线的绘制

准确吸取0.050，0.100，0.250，0.500，1.000，1.500和2.000 mL 500 μg/mL IgG标准储备液，用0.05 mol/L磷酸盐缓冲液定容至5 mL，得到质量浓度为5.0，10.0，25.0，50.0，100.0，150.0和200.0 μg/mL的标准工作液。

2.1 前处理条件的选择

2.1.1 洗脱液接收体积

试验中分别对0～0.5，0.5～2.5，2.5～3.0和3.0～3.5 mL洗脱液进行接收，上机进行分析。由图2可以看出，前0.5 mL和3.0～3.5 mL没有目标物质，2.5～3.0 mL有少量目标物质，因此在洗脱液接收时，弃去前0.5 mL，收集后2.5 mL就能保证目标物质完全接收。

图2 洗脱液接收体积分析

2.1.2 滤膜的选择

分别选取材质为聚醚砜和聚四氟乙烯的0.45 μm滤膜对标准溶液进行过滤分析，结果发现在相同条件下，通过聚醚砜材质水相滤膜的标准品峰面积与直接进样的标准品峰面积相比基本相近，而通过聚四氟乙烯材质滤膜的标准品峰面积则损失44%。因此上机检测时，如洗脱液过于浑浊，可以采用聚醚砜材质水相滤膜进行过滤；
对于不浑浊的洗脱液，也可以直接混匀后上机检测。

2.2 仪器条件的选择

在流速、柱温、进样量相同的条件下，选取不同比例的流动相进行分析。由表1可得，当乙腈∶0.1%三氟乙酸3∶7时，IgG没有出峰，当比例为7∶3，6∶4，5∶5和4∶6时，IgG均有出峰，且在5∶5时标准品峰面积最大。此外，结合高旭等[6]研究表明，柱温过高时，IgG热稳定性会降低，导致峰面积减小。因此选择乙腈∶0.1%三氟乙酸比例5∶5、柱温采用室温的仪器条件。

表1 流动相比例对标准品峰面积的影响

2.3 线性范围、检出限和定量限

将IgG标准工作溶液由低质量浓度到高质量浓度依次进样，获得不同质量浓度下的峰面积，以峰面积为横坐标，质量浓度为纵坐标绘制标准曲线，并进行线性回归。回归方程为Y=0.001 548 27X+2.125 33，相关系数R2=0.999 6，线性范围为5～200 μg/mL，线性关系良好，见图3。

图3 IgG标准曲线

牛奶称样量20 g时，以3倍信噪比（S/N）计算得检出限为10.0 mg/kg，以10倍信噪比（S/N）计算得定量限为30.0 mg/kg；
奶粉称样量2 g时，计算得检出限为100 mg/kg，定量限为300 mg/kg。

2.4 回收率和精密度试验

分别对超高温灭菌乳和奶粉进行3个加标水平的基质加标回收试验，并做6份平行试验，计算平均回收率和相对标准偏差，结果见表2，回收率在92.4%～ 98.0%之间，相对标准偏差（SRSD，n=6）在0.914%～ 1.52%之间。结果表明试验具有良好的精密度和准确度。

表2 2种基质的加标回收和精密度试验结果

用亲和柱结合免疫球蛋白，C18色谱柱进行分离，对牛奶及奶粉中免疫球蛋白的测定进行研究。相关系数R2为0.999 6，牛奶基质检出限为10.0 mg/kg，定量限为30.0 mg/kg；
奶粉基质检出限为100 mg/kg，定量限为300 mg/kg。回收率为92.4%～98.0%，相对标准偏差为0.914%～1.52%。该方法精密度良好、准确度高，可适用于牛奶及奶粉中IgG含量的测定。

猜你喜欢 磷酸盐滤膜缓冲液 壳聚糖-单宁酸疏松型复合纳滤膜制备工艺与性能研究沈阳建筑大学学报（自然科学版）(2022年4期)2022-11-15疏松型印染废水分离复合纳滤膜的性能研究辽宁化工(2022年3期)2022-04-06镁修饰多壁碳纳米管吸附回收污水中磷酸盐大连理工大学学报(2022年2期)2022-03-25SEMA3A、SEMA3B蛋白免疫组化染色中抗原修复方法的优化临床与实验病理学杂志(2021年10期)2021-12-13大气中颗粒态汞的滤膜采样及分析探讨皮革制作与环保科技(2021年14期)2021-11-12pH（酸度）计的选择、使用及保养商品与质量(2021年31期)2021-08-20纳滤膜在盐化工废水处理中的应用思路浅述科学家(2021年24期)2021-04-25新型醋酸纤维素薄膜电泳缓冲液的研究中国科技纵横(2021年24期)2021-03-02A close look at Nauru’s ecosystem疯狂英语·新读写(2018年3期)2018-11-29每天六勺南瓜籽护心脏养生保健指南(2018年3期)2018-04-13