穆耀辉，娄慧敏，程亚倩，王军霞，邓金华，郑 玺，叶爱萍，黄金辉，艾绥龙，王平平，张立新

(1. 陕西省烟草公司商洛市公司，陕西 商洛 726000；
2. 西北农林科技大学 生命科学学院，陕西 杨凌 712100；
3. 陕西省龙草坪林业局，陕西 杨凌 712100；
4. 陕西省烟草科学研究所，陕西 西安 710000)

硅是存在于地壳中的元素，其含量高达31%，是仅次于氧的第二大元素[1～2]。在自然界中，硅在不同地区土壤中含量不同，在不同种属间也不同。在孙德权等人的研究中，纳米硅可以被植物的根部吸收，进入到细胞内部后，再被转运到各个细胞器，组成细胞组分或调节植物的生长发育等，还可通过共质体或质外体途径迁移，并在植物不同组织中进行积累[3]。孙梦梦等的研究中，硅元素具有许多调控作用，如调控植物抗逆性、光合作用以及对植株中镉的化学形态和分布的调控[4]。此外，硅肥能为作物提供硅营养、调节土壤中的氮磷钾等养分供给、增加作物抗非生物胁迫以及生物胁迫的能力，促进植物生长，改善作物的品质[5]。在逆境胁迫下，硅对植物生长的影响广泛，如抗旱[6]、抗盐[7]、抗病[8]、抗重金属[9]、抗虫[10]等。

植物内生真菌是指生活在植物组织中的微生物，包括细菌和真菌，他们并不会明显损害植物[11]。经过多年的进化历程，植物内生真菌与植物形成互利共生的关系，内生真菌通过刺激植物产生某些植物激素，从而使其能够抵御某些虫害、病害、非生物胁迫等[12]。一些内生真菌存在于植物组织的全部或部分生命周期，并可能保护植物宿主免受病原体、昆虫食草动物甚至非生物胁迫的危害，如干旱、热、盐度等[13～15]。

据估计，在大约30万种陆地植物物种中，分布着超过100万种植物内生真菌[16]。某些内生真菌能够产生与其植物宿主相同或相似的活性物质，这为这类活性物质的提取提供了巨大的便利；
也使得植物内生真菌在寻找新药方面得到广泛应用，作为抗菌剂应用于市场[11,17]。目前，关于烤烟内生真菌对其化学成分及香气物质等品质的影响的研究较多，而对其内生真菌群落结构的影响及其影响机制的研究较少。因此，笔者以烟草为研究材料，对其叶片内生真菌进行提取及高通量测序，从不同水平分析对烟叶内生真菌群落组成及结构的影响，利用RDA分析烤烟烟叶化学成分及致香物质与群落组成的相关性，以期明确施硅对烟草内生真菌种群结构的影响，进一步为相关研究提供研究材料。

1.1 供试材料与试验地

烤烟由陕西省烟草科学研究所提供，品种为云烟99，种植于陕西省商洛市洛南县永丰镇。其土壤类型为黄棕壤土，基本性质:pH=5.43，有机质含量11.35 g/kg，速效氮、磷、钾含量分别为52.76 g/kg，26.08 g/kg，126.00 g/kg。普通硅肥采用宝来化肥有限公司(烟台)，主要成分为硅酸钠，硅含量15%。纳米硅采用山东优索化工科技有限公司，颗粒直径范围为8～15 nm，主要成分为SiO2,硅含量为30%。

1.2 试验设计与样品处理

田间试验采用随机区组设计，肥料施用按当地标准进行，施用量为2 250 kg/hm2处理设置分别为CK(喷施清水)、T5(0.17 kg/hm2普通硅)、T8(0.32 kg/hm2纳米硅)。每个处理重复三次，小区面积91.2 m2，植烟160 株，分别于旺长期、现蕾期、圆顶期喷施。在成熟期采集烟株样品，每个处理选取三片具有代表性的中部烟叶(从下向上数第十片叶)，放入冷链箱中，用于后续烟叶内生真菌高通量测序。

1.3 DNA提取与高通量测序

样品送往美吉生物公司进行内生真菌的高通量测序。测序前用流动水多次进行冲洗，确保干净，无污物。随后对其表面进行消毒，使用75%乙醇浸泡1 min，1%次氯酸钠3 min，消毒期间不断摇晃，使消毒试剂与烟叶充分接触，后用无菌水洗涤3 次，用第三次清洗水进行平板涂布，确认消毒彻底后进行DNA的提取和高通量测序。

1.4 数据分析

数据分析参考谢红炼等人的方法[18]。数据优化使用Flash(Vertion1.2.11)、Qiime(Vertion1.9.1)、Fastp(Vertion0.19.6)进行分析。OTU序列聚类、统计、注释使用Uparse(Vertion7.0.1090)、Usearch(Vertion7)、RDP Classifier(Vertion2.11)进行分析。随后，再将分类好的OTU序列与真菌ITS数据库UNITE(Vertion8)进行比对，统计各样本在不同分类水平(Domain(域)，Kingdom(界)，Phylum(门)，Class(纲)，Order(目)，Family(科)，Genus(属)，Species(种))上的物种组成。样品Alpha多样性分析使用分析软件Mothur(Vertion1.30.2)进行。通过Student’s t检验(Student’s t test)来检验指数组间差异。NMDS分析利用软件Qiime(Version1.9.1)对数据进行分析。最后，用VIF方差膨胀因子分析筛选去掉无用的环境因子(VIF值大于10)后，对数据进行RDA分析(R语言vegan包中RDA分析和作图)。

2.1 硅及纳米硅对烤烟烟叶内生真菌群落多样性的影响

由图1可知，随着样品序列的增多，曲线呈先增高后逐渐趋于稳定的状态。可见在本试验中，测序序列数目选用较合理，再增加序列数目，OTU数目的变化并不是很大。在内生真菌OTU稀释曲线中，CK喷施清水、T5喷施硅、T8喷施纳米硅，可看出喷施硅和纳米硅后，内生真菌数目逐渐下降，多样性降低。

图1 不同处理烤烟叶片内生真菌OTU稀释曲线

对烤烟内生真菌的9 个样本进行高通量测序后，其原始序列数目及有效序列数目分别如表1所示。将表中有效序列进行97%一致性聚类分析后，发现其OTUs在123-326之间；
进行α多样性指数比对分析后，发现其Chao指数没有显著性差异，在124.88-195之间，相较于CK组来说，群落丰富度降低，但不显著。通过Shannon指数来看，差异较显著，说明喷施纳米硅使群落中物种多样性显著高于硅。通过比较simpson指数，发现喷施硅及纳米硅后，其数值降低，但差异不显著。总体来看，在一定程度上，喷施硅及纳米硅使烤烟内生真菌的丰富度降低，多样性增加。

表1 测序数据及α多样性指数的统计

2.2 硅及纳米硅对烤烟烟叶内生真菌群落组成的影响

将OTU序列与真菌ITS库进行比对后，分别统计门、纲、目、科、属、种水平群落组成。在门水平上，结果如图2所示，相对丰度较高的是子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)。且相较于CK来说，子囊菌门占总序列的比例有所下降，担子菌门的有所升高。

对其进行纲水平的分析，结果如图3，发现7 类真菌，最优势菌纲为座囊菌纲(Dothideomycetes)，相对丰度分别是45.64%、42.24%、62.60%，可见喷施硅和纳米硅后，其优势菌种类不变，但相对丰度改变。

对目水平进行分析后，结果如图4，各处理优势菌种类基本不变，但相对丰度改变。格孢腔菌目(Pleosporales)均占比较高，分别为36.81%、33.57%、32.62%，且格孢腔菌目是CK、T8的最优势菌。

图2 不同处理烤烟叶片内生真菌门水平上的群落组成

图3 不同处理烤烟叶片内生真菌纲水平上的群落组成

图4 不同处理烤烟叶片内生真菌目水平上的群落组成

对科水平进行分析后，得到heatmap图(如图5)，可见不同处理间科水平真菌群落组成分布存在差异，丰度较CK组低的有Debaryomycetaceae、Trimorphomycetaceae、Hypocreales_fam_Incertae_sedis、Helotiaceae柔膜菌科、Cystobasidiaceae囊担菌科、科水平未分类的银耳目unclassified_o__Tremellales、目水平未分类的粪壳菌纲unclassified_c__Sordariomycetes、Nectriaceae丛赤壳科、Mortierellaceae被孢霉科、Xylariales_fam_Incertae_sedis、Torulaceae、Trichosporonaceae；
较CK组高的有Erysiphaceae白粉菌科、Periconiaceae、科水平未分类的煤炱目unclassified_o__Capnodiales、Chaetomiaceae毛壳菌科、Halosphaeriaceae海殼菌科。说明喷施硅及纳米硅后，其科水平群落组成改变。

图5 不同处理烤烟叶片内生真菌科水平上的群落组成

2.3 硅及纳米硅对烤烟烟叶内生真菌群落结构的影响

由图6可知，CK处理烤烟烟叶的优势属(丰度≥1%)为Cladosporium枝孢属(23%)、Filobasidium线黑粉酵母属(2.05%)、Alternaria链格孢属(12.23%)、Sporobolomyces掷孢酵母属(6.16%)、Epicoccum附球霉属(1%)、Paraphoma异茎点霉属(5.11%)、Septoria壳针孢属(1.19%)。

T5处理烤烟烟叶的优势属为Cladosporium枝孢属(6.57%)、Filobasidium线黑粉酵母属(4.37%)、Alternaria链格孢属(12.67%)、Paraphoma异茎点霉属(5.26%)、Epicoccum附球霉属(3.01%)、Dioszegia(2.85%)、Septoria壳针孢属(1.02%)、Sporobolomyces掷孢酵母属(7.34%)、Hannaella汉纳酵母属(1.79%)。

T8处理烤烟烟叶的优势属为Cladosporium枝孢属(10.36%)、Alternaria链格孢属(12.22%)、Sampaiozyma(3.78%)、Septoria壳针孢属(1.14%)、Vishniacozyma维希尼克氏酵母属(1.6%)、Sporobolomyces掷孢酵母属(4.89%)、Meyerozyma毕赤酵母属(1.69%)、Filobasidium线黑粉酵母属(10.6%)、Rhodotorula红酵母属(1.09%)、Saitozyma(1.14%)。

总体来看，与CK相比，T5、T8处理属的种类及丰度均有不同程度的改变，其中T5、T8减少了Cladosporium枝孢属的丰度，分别降低到了6.57%、10.36%；
增加了Filobasidium线黑粉酵母属丰度，分别增加到4.37%、10.6%。此外，T5优势属增加了Dioszegia(2.85%)、Hannaella汉纳酵母属(1.79%)，T8处理优势属增加了Sampaiozyma(3.78%)、Meyerozyma毕赤酵母属(1.69%)、Vishniacozyma维希尼克氏酵母属(1.6%)、Rhodotorula红酵母属(1.09%)、Saitozyma(1.14%)，减少了Paraphoma异茎点霉属、Epicoccum附球霉属。可见，通过施加硅和纳米硅可以改变内生真菌的丰富度和多样性，从而改变其种群结构。

在种水平，如图7，CK附生真菌群落中的占比≥1%种为枝孢属Cladosporium_delicatulum(22.98%)、异茎点霉属Paraphoma_chrysanthemicola(4.99%)、线黑粉酵母属Filobasidium_magnum(2.05%)、附球菌属Epicoccum_nigrum(1%)、掷孢酵母属Sporobolomyces_oryzicola(5.89%)。

图6 不同处理烤烟叶片内生真菌属水平上的群落组成

T5处理的占比≥1%种为枝孢属Cladosporium_delicatulum(6.55%)、附球菌属Epicoccum_nigrum(3.01%)、掷孢酵母属Sporobolomyces_oryzicola(6.74%)、异茎点霉属Paraphoma_chrysanthemicola(5.16%)、线黑粉酵母属VFilobasidium_magnum(4.34%)、Dioszegia_zsoltii_var._yunnanensis(1.85%)。

T8处理的占比≥1%种为枝孢属Cladosporium_delicatulum(10.27%)、掷孢酵母属Sporobolomyces_oryzicola(4.58%)、Saitozyma_podzolica(1.14%)、桑帕约氏酵母Sampaiozyma vanillica(3.78%)、维希尼克氏酵母属vishniacozyma-carnescens(1.28%)、线黑粉酵母属Filobasidium_magnum(10.53%)、季也蒙毕赤酵母meyerozyma-guilliermondii(1.69%)。

种水平的变化结果与属水平相似。结果表明，喷施硅及纳米硅后枝孢属Cladosporium_delicatulum含量下降，种水平未分类的链格孢属unclassified_g_alternaria含量稳定，线黑粉酵母属Filobasidium_magnum含量增加。此外，喷施硅后附球菌属Epicoccum_nigrum含量增加2.01%，Dioszegia_zsoltii_var._yunnanensis含量增加1.6%。喷施纳米硅后烤烟烟叶异茎点霉属Paraphoma_chrysanthemicola、附球菌属Epicoccum_nigrumV含量下降，较CK下降3.23%、0.08%。新出现季也蒙毕赤酵母meyerozyma-guilliermondii(1.69%)、Saitozyma_podzolica(1.14%)优势种。优势菌种改变，可见喷施硅及纳米硅使得烟叶的种群结构发生改变。

图7 不同处理烤烟叶片内生真菌种水平上的群落组成

对不同处理烤烟烟叶片进行分析，做出Venn图，其描绘了每个样本唯一的或在多个样本之间共享的物种数目，并直观地显示了样本之间的物种数重叠。与CK相比，T5特有物种有67种；
T8有130种。随后，对不同处理进行NMDS分析，如图8(c)发现喷施硅及纳米硅后，物种的群落组成受到影响。

图8 不同处理烤烟叶片内生真菌群落韦恩

2.4 内生真菌群落组成与烟叶化学成分及香气物质之间的相关性

对烤烟化学成分与内生真菌进行相关性分析，结果如图9，可见烟碱及可溶性蛋白与各处理显著相关；
而钾、淀粉、可溶性糖与其相关性未达到显著水平。因此，推测喷施硅及纳米硅后，其内生真菌群落水平的变化可能与其化学成分的改变有关。

在杨沫等的研究中，小芒森干白葡萄酒酿造过程中，微生物群落丰度及多样性对醇酯类等香气物质的含量具有影响。其香气物质总含量呈增加趋势，且酯类物质的含量增加最为明显[19]。在Shen Yan等人的研究中，对土壤微生物与烟草香气成分进行了RDA分析，检测了40种关键系统类型微生物，发现其中11种与烟草香气呈显著相关[20]。于是，在本研究中，为了评估烤烟烟叶内生真菌与香气物质之间的相关性，我们也对其进行了RDA分析，结果如图10所示，可以看出，总香气物质与各处理具有显著相关性；
美拉德反应产物及类西柏烷类降解产物与各处理间具有相关性，但未达到显著水平。因此，推测香气物质的含量变化可能与烤烟烟叶内生真菌种群结构的变化有关。

图9 烟叶化学成分与烤烟烟叶内生真菌目水平

图10 不同处理烤烟烟叶内生真菌目水平群落组成与

3.1 施用硅及纳米硅对烤烟烟叶内生真菌的影响

硅在地球上的含量仅次于氧。在不同的土壤中，其含量差别较大，在不同植物种属中的含量也不同。纳米硅以其分子较小，而能够通过质外体途径进入到植株内。在孙德权等对纳米硅材料的研究中，发现其本身对植物没有毒性，在一定程度上，能够促进植物种子萌发，也能提高植物对非生物胁迫的抵抗能力，增加抗重金属的能力[3]。但纳米硅的累积效应也使得对其的使用存有争议。例如，在植物的下一代中能够检测到纳米硅的存在[21]。

在本研究中，T8处理的物种组成差异较CK与T5的较大，表明纳米硅喷施后烟叶内生真菌丰度改变，同时其种群结构也改变，这与周家喜等人的研究结果是一致的[22]。随后又利用生物学软件对烤烟烟叶内生真菌不同水平进行分析，发现在不同水平上其优势菌群的丰富度不同，且种类也有变化。如T5与T8处理中，内生真菌枝孢属Cladosporium的丰度下降，线黑粉酵母属Filobasidium丰度增加。在Venkateswarulu N等人的研究中，枝孢属可以产生白花丹醌，而后者具有抗菌和抗病毒作用[23]。在韩龙等人的研究中，线黑粉酵母属可以产生淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、果胶酶、几丁质酶，而这些酶可以被分泌到胞外并降解烟叶内的大分子有机化合物，产生香气物质[24]。此外，T5优势属增加了Dioszegia(2.85%)、Hannaella汉纳酵母属(1.79%)，T8处理优势属增加了Sampaiozyma(3.78%)、Meyerozyma毕赤酵母属(1.69%)、Vishniacozyma维希尼克氏酵母属(1.6%)、Rhodotorula红酵母属(1.09%)、Saitozyma(1.14%)，减少了Paraphoma异茎点霉属、Epicoccum附球霉属。而异茎点霉属 Paraphoma_chrysanthemicola 可以提高植株对重金属和黄瓜枯萎病的抗性[25]。附球霉属 Epicoccum 菌株可以产生抗真菌化合物，防治真菌病害[26]。

通过笔者研究也可以明确不同条件下其优势菌群的变化，为进一步提高烟草的生长发育创造更加有利的环境，对提高烟草产量和质量及烟草中的某些化学成分提取具有某些重要意义。但对其具体的影响机制还不清楚，以后还有待在这方面进行更加深入的研究。

3.2 内生真菌群落组成与烟叶化学成分及香气物质之间的相关性

在杨永锋等人的研究中，高碳基肥料和绿色木霉配施处理后，西柏烷类香气物质茄酮的含量达到60.50±2.60 ug/g，与对照及单一处理相比含量升高明显，具有显著性差异[27]。在龙丹等的研究中，微生物制剂对茶叶香气具有提升作用，如包括β-葡萄糖苷酶、β-樱草糖苷酶、半乳糖苷酶等在内的微生物酶制剂和包括霉菌、细菌、酵母菌在内的微生物发酵剂[28]。说明在一定程度上，微生物对烤烟香气物质的含量是有影响的，这与本研究的结果一致。在笔者研究中，内生真菌的群落组成与总香气物质的含量具有显著相关性。此外，在郑坚强等人的研究中，对烤烟烟叶香气物质生成相关的微生物进行了分离与鉴定，获得了降解β-胡萝卜素生成香气物质的微生物，最终对分离得到的3个菌株鉴定为丝状酵母属菌株[29]。可见，在一定程度上，植物内生真菌对烤烟香气物质是具有影响的。

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